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       【摘要】 
       目的从中药中寻找安全有效的多药耐药逆转剂,并初步研究三七总皂苷(PNS) 对人乳腺癌细胞MCF-7/S(敏感细胞) 及MCF-7/ADM(耐药细胞) 的影响。方法以MTT 法测定PNS对MCF-7/S 及MCF-7/ADM的直接细胞毒作用；测定阿霉素(DOX) 对两种细胞的毒性作用并计算出耐药倍数；以无细胞毒性的三七总皂苷注射液作为耐药逆转剂用MTT法体外药敏感实验观察其对多药耐药细胞株MCF-7/ADM的逆转作用；用RT-PCR分别测敏感细胞和PNS作用后的耐药细胞表达的MDR1基因的阳性率；用WESTERN测定敏感细胞和PNS作用后的耐药细胞表达多药耐药蛋白P - gp (P - 170) 的阳性率。以上实验均用维拉帕米作为阳性对照。结果①PNS在300μg/ ml 浓度以下时对两细胞基本无毒性,为安全有效的逆转剂量。②阿霉素对敏感细胞和耐药细胞的半数抑制浓度( IC50) 分别为0.62μg/ ml 和25.03 μg/ ml，耐药倍数为40.37倍。③PNS能够增强阿霉素(DOX) 对MCF-7/ADM的细胞毒作用, PNS 50，100，200μg/ ml分别作用于乳腺癌耐药细胞48 h后，耐药细胞株的IC50分别降至17.85，13.80，11.63 μg/ml。④PNS(50，100，200μg/ ml) 均可下调多药耐药基因mdr - 1 及其表达的糖蛋白P - gp 的量,且随PNS浓度的增加，下调作用更加明显。而未发现维拉帕米有类似作用。结论①高浓度的三七总皂苷具有一定的抗肿瘤作用；②三七总皂苷可下调MCF-7/ADM的MDR-1和P-gP；③PNS能够部分逆转耐药细胞MCF-7/ADM的多药耐药性；④三七总皂苷是一种有效安全的多药耐药逆转剂。
       【关键词】  乳腺癌 三七总皂苷 多药耐药 逆转 体外研究
       Reversal Effect of Panaxnotoginseng Saponins on Multidrug Resistance Breast Cancer Cell MCF/ADM
       LIU Lili, LIU Yane FANG Guotao
       (Second Affiliated Hospital of Dalian Medical University, Dalian 116027, China)
       Abstract：ObjectiveTo search a sort of safe and effective reversal agent for multidrug resistantce from Chinese traditional medicine and to study the impact of the Panaxnotoginseng saponins (PNS) on human breast clone MCF-7/S and  multidrug resistance clone MCF-7/ADM in vitro. MethodsTo measure direct cell toxicant effect of PNS to MCF-7/S(sensitive strain) and MCF-7/ADM (multidrug-resistant strain) and measure toxicant effect of dox to both strains for resistant index by MTT;to observe the reversal effect of  PNS which has screened for nontoxicant concentration to MCF-7/ADM by MTT;to measure expression positive rate of mdr-1 and P-gp of the both cell after treatment with PNS by PCR and WESTERN .Veraparmil was used as a positive control.Results①There was no obvious cell toxicity of PNS to MCF-7/S and MCF-7/ADM cell,when the concentration of PNS was 300 μg/ml below. ②IC50 of Dox to MCF-7/S and MCF-7/ADM were 0.62 ng/ml and 25.03 ng/ml respectively.Drug-Resistant index of MCF-7/ADM was 40.37.③PNS could increase cell toxic effect of dox,after treated with could reduce manner 50，100，200 μg/ml PNS respectively to MCF-7/ADM for 48 hours,IC50 respectively declined to 17.85，13.80，11.63 μg/ml(P<0.01);④PNS(50，100，200μg/ ml) could reduce the expression of mdr-1 and P-GP.  No significant effect was observed with verapmil.Conclusion①High concentrationof PNS had certain tumor-resistant effect；②PNS could reduce the expression of mdr-1 and P-GP of MCF/ADM ；③PNS could partly revese multidrug-resistance of MCF-7/ADM in vitro；④PNS can be a kind of safe and efficient reversal agent for clinic.
       Key words：Breast carcinoma;  Panaxnotoginseng aponins;  Multidrug resistance；  Reversal;  Research in vitro
       乳腺癌是危害妇女健康的主要恶性肿瘤，占女性肿瘤发病率的第二位，乳腺癌是实体瘤中应用化疗最有效的肿瘤之一，化疗在整个治疗中占重要的地位，但由于多药耐药现象的产生而导致化疗失败并由此引起的复发和转移，限制了许多抗癌药(特别是植物类)的临床应用［1］。MDR的主要机制之一是细胞过量表达了一种膜P糖蛋白(P·glycoprotein．PGP，分子量l70～180KD)，它通过消耗ATP将药物从细胞内快速 “泵出”细胞，致细胞内药物聚集减少，产生耐药［2］。研究表明许多非化疗药物如异博定、三氟拉嗪等都能逆转抗癌药物的耐药，其主要机制是使MDR细胞“药物外排”系统失活，细胞内聚集的药物总量增加。从而提高抗癌药物的药理效应，但这些逆转剂对机体副作用较大，影响临床推广应用 。目前，许多研究室都致力于研制和开发低毒、高效的逆转药物，本实验从中药宝库中筛选的PNS经体外研究证实其能够逆转耐ADM 人乳腺癌细胞MCF-7/ADM 对ADM的耐药 。为进一步阐明PNS的作用机制，本文应用现代分子生物学技术，从蛋白质和RNA水平对其逆转机制进行了探讨。
       1  材料
       1.1  细胞株人乳腺癌细胞株MCF-7/S由大连医科大学附属二院中心实验室提供，具有多药耐药表型的耐阿霉素细胞株MCF - 7/ ADM购自中国医学科学院天津血液学研究所。
       1.2  药物及试剂　
       主要试剂：阿霉素(Adriamycin) (意大利法玛西亚普强公司)。阿霉素用生理盐水配成10 mmol/ L 的工作母液, 三七先用DMSO溶解,然后用生理盐水配成10 mmol/ L 的工作母液,使用时用DMEM培养液配成相应浓度应用液。工作母液分装后,避光保存于4 ℃冰箱，鼠抗人P-gp单克隆抗体、生物素标记的抗体（二抗）、辣根过氧化物酶标记的卵白素（酶）均购于北京中杉生物技术有限公司，Trizol试剂盒（美国Invitrogen公司），RT-PCR试剂盒，DNA Marker，6X Loading Buffer，低熔点琼脂糖、MDR1，MRP基因及β2微球蛋白（β2-MG）PCR引物均购于大连宝生物工程有限公司。
       2  方法
       2.1  细胞培养　
       敏感细胞株MCF - 7/ S 于含10 %小牛血清、100 mg·L-1青霉素和100 mg·L-1链霉素的RPMI1640 培养液中，在37 ℃、饱和湿度及5 %的细胞培养箱内传代培养。相应耐药株MCF - 7/ ADM连续培养在含1. 0 mg·L-1阿霉素(ADM) 的上述培养液中，培养条件相同。MCF-7/ ADM耐药细胞实验前两周无药培养，取对数生长的两种细胞株进行实验。
       2.2   步骤
       2.2.1  MTT法测定无或低细胞毒作用的PNS浓度　
       实验分MCF-7/S + PNS，MCF-7/ADM+ PNS，MCF-7/S + Ver，MCF-7/ADM+ Ver 组，取对数生长的MCF-7/S，MCF-7/ADM细胞悬液100 μl 分别接种于96 孔培养板中，每孔细胞数均为105/ 孔，然后加入不同浓度的PNS 溶液(先用DMSO溶解,然后用生理盐水配成10 mmol/ L 的工作母液，使用时用DMEM培养液配成相应浓度应用液) ，使PNS 浓度分别为0，10，100，500，1 000 μg/ ml ,加入Ver 并使之浓度分别为0，0.1，1，5，10 μg/ ml，实验均设3个复孔, 置于37 ℃，5 % CO2培养箱中孵育48 h 后加入MTT 20 μl ，作用4 h 后平板离心机1 000 r/min 离心，弃去上清液，加入DMSO 100 μl ，微量振荡10 min ,酶标仪检测波长570 nm 时OD值(吸光度) 。计算PNS 和Ver 的IC50 (半数抑制量) 值。
       2.2.2  用MTT法测定MCF-7/ADM耐药细胞株对DOX，VCR 的耐药倍数(耐药细胞IC50/ 敏感细胞IC50)
       实验分MCF-7/S +DOX ，MCF-7/ADM+DOX ，MCF-7/S + VCR ，MCF-7/ADM+ VCR 组，取不同浓度的DOX和VCR浓度。具体方法同(1) 。分别计算DOX，VCR 对耐药细胞的IC50值和耐药细胞的耐药倍数(耐药细胞IC50/ 敏感细胞IC50) 。
       2.2.3  测定PNS 对 MCF-7/ADM 耐药细胞的逆转作用　
       实验分 MCF-7/ADM + DOX，MCF-7/ADM + PNS (3 个浓度) + DOX、MCF-7/ADM+ Ver + DOX组,PNS 取第一步筛选的无细胞毒性浓度分别为50，100，200 μg/ ml ，每个浓度设3 个复孔，Ver 取1μg/ ml (无细胞毒性,细胞存活率98 %以上) ，设3个复孔。DOX 浓度取0，0.1，1，10，100 μg/ ml 。余法同(1) 。计算DOX对MCF-7/S的IC50并计算PNS 和Ver 的逆转倍数(逆转前IC50/ 逆转后IC50) ，每次实验重复3次。
       2.2.4  PCR仪测定MDR-1基因表达
       取数生长期的MCF-7/S和MCF-7/ADM细胞接种于六孔板中，其中1孔为阴性对照MCF-7/S，1孔为MCF-7/ADM阳性对照，1孔为MCF-7/ADM+ Ver (5 μg/ml)，其余3孔待贴壁后分别加入终浓度为50， 100，200 μg/ ml的PNS+MCF-7/ADM培养48 h后，取灭菌后无Rnase的小离心管，采用Trlzol试剂提取各组总RNA，经AMV 逆转录酶系统合成cDNA。逆转录系统构成如下：MgCl2 2μl，10 ×RNA PCR Buffer 1 ，dNTP mixture 1，Rnase 0.25，反转录酶0.5，Random 9mers 0.5 μl总RNA 1 μg，DEPC水4 μl，共10 μl，反应条件为 30℃ 10 min，42℃ 1h,99℃ 5min,5℃ 5min。PCR 反应系统构成如下: 在10 μl的cDNA产物中加入MgC123 μl，10 x LC PCR Buffer4 μl、Taq 酶0.25 μl 、MDR1引物、β2-MG引物（上下游引物均为0.5 μl）、蒸馏水30.75 μl，反应体系50 μl，混匀后离心数秒。引物序列: MDR-1：上游5" - CCCATCATTGCAATAGCAGG- 3" ； 下游5" - GTTCAAACTTCTGCTCCTGA- 3"； 扩增产物157 bp。β2-MG：上游 5" - ACCCCCACTGAAAAAGATGA- 3" ； 5" - ATCTTCAAACCTCCATGATG- 3" ，扩增产物120 bp。扩增条件: 94℃预变性2 min, 进入循环94℃ 30 s, 55℃ 30 s, 72℃ 60 s, 共35个循环, 最后72℃延伸10 min。取10 μl PCR 产物在2%琼脂糖凝胶电泳分离, 溴化乙锭染色，实验重复3 次，UVP 凝胶成像系统扫描, 并用Gelbase电脑软件进行光密度分析， 以MDR1与β2-MG的RT- PCR 产物吸光度比值作为MDR1 mRNA 的相对含量。
       2.2.5  Wesrern blotting检测P-gp的表达   
       取上述的各组细胞（每组细胞约1×108个）, 每组加入200 μl 细胞裂解液( 50 mmol /L Tris - HCl pH8.0，150 mmol /L NaCl，5 mmol /L EDTA、1%triton X- 100、1 mmol PMSF) ,冰浴上超声粉碎, 4℃离心7 min( 11 000 r/min) , 取出上清液（蛋白）, 分光光度计下测量样品的纯度，计算浓度及100 μg蛋白所需的样品的容积数。取蛋白样品各100 μg 上样, 经SDS- PAGE 电泳进行蛋白转膜, 加入5%脱脂奶粉封阻90 min, 加入一抗P-gp （1∶160）4℃过夜，TTBS洗膜15min X 3次，加二抗37℃40 min，TTBS洗膜15 min×3次，加辣根过氧化物酶37℃40 min，TTBS洗膜15 min×3次，DAB显色。实验重复3 次，UVP 凝胶成像系统扫描成像，比较各条带的吸光度值。
       2.2.6  统计学处理  
        
       数据用±s表示，采用 SPSS 12.0 软件对数据进行t检验，P<0.05 为统计学检验有显著性差异。
       3  结果
       3.1   PNS 和Ver 对MCF-7/S，MCF-7/ADM的细胞毒性PNS 对MCF-7/S，MCF-7/ADM 的细胞毒性很小,其在300 μg/ ml 浓度以下时对两组细胞基本无毒性，细胞存活率均在98 %以上，500 μg/ml 以上随着浓度的增大其细胞毒性作用明显增加。Ver 在7 μg/ ml 以上时具有明显的细胞毒性作用，且毒性作用与其浓度呈正相关。PNS 和Ver 分别对两种细胞的IC50无明显差别( P>0.05) 。结果见表1。
       3.2   MCF-7/S对化疗药物VCR，DOX的耐药倍数　
       见表1。表1  DOX，VCR，PNS和Ver对MCF-7/S和MCF-7/ADM的IC50值（略）
       3.3   PNS 对MCF-7/S耐药细胞的逆转作用　
       见表2。不同浓度的PNS能不同程度地增强ADM 对MCF-7/ADM细胞的杀伤作用，提高细胞对ADM的敏感性，表现为IC50下降，对ADM 的敏感性提高至原来的1.4～2.1倍，但仍远高于敏感株MCF-7/S的IC50［(0.62±0.03) μg/ ml］，说明PNS能降低MCF-7/ADM细胞对ADM 的抗性，并具有一定的协同作用，且作用强度与PNS的剂量呈正相关。表2  加入Ver和不同浓度的PNS对DOX作用于耐药细胞的影响（略）
       3.4  PNS 对 MCF-7/ADM表达MDR-1的影响结果见图1～2及及表3。表3  PNS和VER对MCF-7/ADM细胞MDR1 mRNA和P- gp蛋白表达的影响（略０
       4  讨论
       肿瘤细胞的多药耐药性（MDR）是指肿瘤细胞对一种药物耐药的同时，对其他结构和作用机制不同的药物也产生交叉耐药性。多药耐药性是肿瘤诸多恶性表现之一，是多基因、多阶段、多步骤和多因素作用的结果，其发生机制很复杂，受各种内源性和外源性因素的影响，其中膜糖蛋白介导的药物外排机制是其重要机制之一。P-糖蛋白( P-gp)是最具有代表性也是近几年研究最多最清楚的膜糖蛋白。P-糖蛋白( P-gp)是定位于人染色体7q21.1上的MDR-1基因编码的一种跨膜蛋白，相对分子质量为170 000 。它属于ATP 结合盒转运蛋白超家族成员之一，由两个同源部分组成，每个部分都包含6个疏水跨膜区和1个具有高度保守A TP 结合位点的亲水区，亲水区可能含有2个核苷酸结合位点，而疏水区则含有多个与MDR 有关的药物结合位点［3］，P-gp主要定位在细胞膜，在胞质内也可见其定位于高尔基复合体和溶酶体形成的小泡［4］。“药物膜泵”假说认为P-gp是细胞膜上的一种药物泵，利用水解ATP产生的能量，P-gp可将进入细胞内的药物泵出，降低细胞内的药物浓度，减少药物对肿瘤的杀伤作用，引起肿瘤细胞对药物的耐受，从而产生MDR。
       阿霉素 PNS 维拉帕米 单位均为μg/ ml，所在组   PNS( Panaxnotoginseng saponins , PNS) 是从中药三七中提取出的一组有效成分，具有活血化瘀和补益作用，来源丰富，价格便宜,毒副作用小。长期以来，补益中药以及活血化瘀中药的增敏作用已经得到充分证实，大多数学者认为目前具有增敏活性的某些药物可能具有潜在的逆转MDR 的活性。史亦谦等［5］已报道PNS具有逆转白血病MDR 的效应，但对其他肿瘤的耐药逆转尚未有报道，为了证实其是否对乳腺癌耐药也有逆转效果，而开展了本项研究。本文采用MCF-7/ADR 为靶细胞进行了逆转研究，并用维拉帕米作为阳性对照，发现PNS 在50～300 μg/ ml 的无细胞毒性范围内能够提高DOX 对耐药细胞的细胞毒作用，而且随着药物浓度的增加其逆转作用逐渐增强,与Ver 比较，PNS 在200 μg/ ml 浓度时其逆转强度明显大于Ver 1 μg/ ml 浓度时的逆转强度。通过PT-PCR和Western的检测发现PNS 能够部分下调多药耐药基因MDR-1 及其表达的P-170 糖蛋白。这可能为其机制，而维拉帕米不影响MDR-1 及其表达的P-170，与史亦谦的结果相符。有报道维拉帕米主要是通过与耐药细胞膜上的P - 170 相结合 ，阻止P - 170 的蛋白磷酸化，减少其药物泵作用使细胞内化疗药物浓度增加从而使多药耐药得以逆转。而PNS在此基础上还可下调多药耐药基因对P-170 蛋白的表达而发挥其逆转作用。
       据此可以推测PNS逆转MCF-7/ADM耐药主要机制是：①直接或间接抑制多药耐药基因表达P-170 糖蛋白，减少其药物的外排作用。②PNS可能与多药耐药基因表达的P - gp 糖蛋白结合，发挥与维拉帕米同样机制的逆转作用。③PNS通过某一组分如以上提到的人参皂苷Rb1 或多种组分来影响P-170 的表达。亦不能排除PNS能够通过其它的逆转耐药途径而起协同作用。
       在临床通过本实验，我们认为高浓度的PNS具有一定的抗肿瘤作用。PNS能够部分逆转耐药细胞MCF-7/ADM的多药耐药性。PNS的主要的多药耐药机制可能是通过抑制多药耐药基因及其表达的P - gp 糖蛋白和(或) 与P - gp 相结合，抑制其药物泵的作用这一途径来实现的。PNS对多药耐药细胞的逆转作用是其活血化瘀和补益增敏作用的体现。PNS与维拉帕米存在不同的逆转机制。
       【参考文献】
         　　［1］魏熙胤，牛瑞芳， 杨 毅，等.流式细胞仪（FCM）在人乳腺癌耐药细胞系耐药逆转研究中的应用［J］.现代仪器，2002，4：36.
       
       ［2］张文卿， 刘叙仪，韩复生，等.中药方剂R 1对耐阿霉素人乳腺癌细胞P糖蛋白表达的影响［J］.中药药理与临床，1996，1(1) ：18.
       
       ［3］刘炳仁,杨纯正. 肿瘤细胞多药耐药基因研究进展［J］.国外医学·药学分册, 1992，19（6）：334.
       
       ［4］陈曦，季天海，姚丽青，等. MDR 基因及MDR 基因编码产物在咽喉部恶性黑色素瘤中表达及其意义［J］.中国现代医学杂志，2002，12 （22）：13.
       
       ［5］史亦谦，田同德 ．三七总皂苷体外逆转K 5 6 2 / VCR 细胞多药耐药的实验研究［J］.中国中医药科技，2005 ，12（5）：292.