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       【摘要】 
       目的建立八珍益母浓缩丸的质量控制标准。方法利用薄层色谱法对八珍益母浓缩丸处方中益母草、党参、茯苓、甘草、白芍（酒炒）等中药进行定性鉴别；采用高效液相色谱法测定八珍益母浓缩丸中盐酸水苏碱的含量。色谱条件：Spherisorb SCX（150 mm×4.6 mm）色谱柱，以磷酸二氢钠溶液（pH3.5）为流动相，检测波长为194 nm，流速为1.0 ml·min-1，柱温为室温，进样量为20 μl。结果益母草、党参、茯苓、甘草、白芍（酒炒）采用相应的薄层鉴别方法，薄层展开后均显示与对照药材相同的特异性斑点，分离效果好。盐酸水苏碱浓度在1.104～8.832 μg·ml-1范围内与峰面积有良好的线性关系，回归方程为Y=533 369X+60 637，相关系数r＝0.996 5（n＝6）。平均回收率为98.38%，RSD为0.24%。结论该方法准确、可靠、专属性强，可用于八珍益母浓缩丸的质量控制。
       【关键词】  薄层色谱法； 高效液相色谱法； 盐酸水苏碱； 八珍益母浓缩丸
       Study on the Quality Standard of Bazhenyimu Concentrated Pill
       TIAN Shuangyan，YUAN Zhifang，CHEN Weiping,ZHANG Lantong
       （Department of Pharmacological Analysis, School of Pharmacyology, Hebei Medical University, Shijiazhuang 050017,China；Hebei Provincial Corps Hospital, Chinese People" s Armed Police Forces, Shijiazhuang 050081, China）
       Abstract：ObjectiveTo establish a quality standard of Bazhenyimu Concentrated Pill. MethodsTraditional Chinese medicine in prescription such as herba Leonuri, Poria, Radix Paeoniae Alba were identified by a series of TLC methods. The content of stachydrine hydrochloride in Bazhenyimu Concentrated Pill was determined by HPLC method. Spherisorb SCX（150 mm×4.6 mm）column was used, the mobile phase was sodium dihydrogen phosphate buffer solution (pH3.5) at the flow rate of 1.0 ml·min-1, the detection wavelength was 194 nm, and the volume of injection was 20 μl.ResultsFive methods were established for the identification of Poria, Radix Paeoniae A1ba, Radix Glycyrrhizae, herba Leonuri and Codonopsis Pilosula with TLC. The principal spot in the chromatogram obtained with the test solution was similar in position, colour and size to the principal spot in the chromatogram obtained with the reference solution. The linear range of stachydrine hydrochloride was within the range of 1.104～8.832μg·ml-1.The regression equation was Y=533 369X+60 637, r＝0.996 5（n=6）. The average recovery was 98.38% and the RSD was 0.24%. ConclusionThe method is accurate, reliable and specific and can be used for the quality control of Bazhenyimu Concentrated Pill.
       Key words：TLC；  HPLC；  Bazhenyimu Concentrated Pill；  Stachydrine hydrochloride
       
       八珍益母浓缩丸由益母草、党参、白术（炒）、茯苓、甘草、当归、白芍（酒炒）、川芎、熟地黄9味中药组成，9味中药均为常用的传统中药材。其中益母草为君药，水苏碱、益母草碱等为益母草的有效成分，因水苏碱为益母草所特有，且含量较大，所以测定八珍益母浓缩丸中盐酸水苏碱的含量并以此作为制剂的含量测定方法，同时利用薄层色谱法对处方中益母草、党参、茯苓、甘草、白芍（酒炒）等中药进行定性鉴别，为该制剂的质量控制提供分析方法。
       1   仪器与试药
       1.1  仪器美国Waters高效液相色谱仪，Waters 2487型紫外检测器，Spherisorb SCX（150 mm×4.6 mm）色谱柱；日本岛津UV-2201紫外-可见分光光度计（日本）；TG332A十万分之一分析天平（上海天平仪器厂）。
       1.2   药品和试药八珍益母浓缩丸（自制）；盐酸水苏碱、芍药苷对照品；甘草、茯苓、党参对照药材均由中国药品生物制品检定所提供；其他试剂均为分析纯；薄层层析硅胶G（化学纯）、薄层层析硅胶GF254（化学纯）：青岛海洋化工有限公司。
       2   方法
       2.1  薄层色谱法定性鉴别
       2.1.1  益母草的鉴别取盐酸水苏碱对照品适量，加甲醇制成每毫升含2  mg的溶液，作为对照品溶液。
       
       另取本品4 g，研碎，加水30 ml使溶解，加稀盐酸调节pH 1～2，滤过，滤液加在强酸型阳离子交换树脂柱［001×7型（732）Na＋型，内径0.9 cm，柱长12 cm］上，以水洗至流出液近无色，弃去水液，再以2 mol/L氨溶液60 ml洗脱，收集洗脱液，水浴蒸干，残渣加甲醇2 ml使溶解，作为供试品溶液。
       
       取党参、白术（炒）、茯苓、甘草、当归、白芍（酒炒）、川芎、熟地黄8味中药按处方工艺制成阴性对照品，再按供试品溶液的制备方法制成阴性对照溶液。
       
       照薄层色谱法［1］吸取上述溶液，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上。以正丁醇-盐酸-醋酸乙酯［2］（8∶3∶1）为展开剂，展开13 cm，取出薄层板，晾干，喷以稀碘化铋钾试液，105℃加热至斑点显色清晰。日光下检视，在相应于对照品盐酸水苏碱的斑点处，供试品中有此斑点，而阴性对照无此斑点。
       2.1.2  甘草的鉴别取甘草对照药材1 g，加乙醇60 ml，超声20 min，滤过，滤液挥干，残渣加乙醇1 ml溶解，作为对照药材溶液。
       
       取八珍益母浓缩丸12 g，研碎，加乙醇60 ml，超声20 min，滤过，滤液挥干，残渣加乙醇1 ml溶解，作为供试品溶液。按相同方法制备阴性对照溶液。
       
       照薄层色谱法［1］吸取上述溶液，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上。以氯仿-醋酸乙酯-甲酸［3］（25∶10∶1）为展开剂，展开13cm，取出薄层板，晾干。置紫外灯（365nm）检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的颜色斑点，而阴性对照无此斑点。
       2.1.3  茯苓的鉴别取茯苓对照药材1 g，加乙醚50 ml，回流提取1 h，滤过，放冷，滤液挥干，残渣加乙醇1 ml使溶解［4］，作为对照药材溶液。
       
       取八珍益母浓缩丸6 g，研碎，加乙醚50 ml，回流提取1 h，滤过，放冷，滤液挥干，残渣加乙醇1 ml使溶解，作为供试品溶液。按相同方法制备阴性对照溶液。
       
       照薄层色谱法［1］吸取上述溶液，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上。以石油醚-乙醚（3∶2）［5］为展开剂，展开13 cm，取出薄层板，晾干。喷以10%磷钼酸乙醇溶液显色。于日光下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色斑点，而阴性对照无此斑点。
       2.1.4  党参的鉴别取党参对照药材1 g，加无水乙醇40 ml超声处理15 min，滤过，滤液中加水40 ml，过滤，滤液挥至无醇味，用氯仿萃取两次，40 ml/次，合并氯仿液，挥干，残渣加氯仿1 ml溶解，作为对照药材溶液。
       
       取八珍益母浓缩丸6 g，研碎，加无水乙醇40 ml超声处理15 min，滤过，滤液中加水40 ml，过滤，滤液挥至无醇味，用氯仿萃取两次，40 ml/次，合并氯仿液，挥干，残渣加氯仿1 ml溶解，作为供试品溶液。按相同方法制备阴性对照溶液。
       
       照薄层色谱法［1］吸取上述溶液，点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上。以苯-醋酸乙酯-甲酸（20∶4∶0.5）为展开剂［6］，展开13 cm，取出薄层板，晾干。喷以10%硫酸乙醇溶液，105℃烘至斑点清晰。于日光下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的灰黑色斑点，斑点清晰，而阴性对照无此斑点。
       2.1.5  白芍的鉴别取芍药苷对照品，加甲醇制成每毫升含1mg的溶液，作为对照品溶液。
       
       取本品6 g， 研碎，加乙醇40 ml，浸渍1 h，振摇、滤过、蒸干，残渣加水20 ml溶解，用水饱和的正丁醇提取3次， 20 ml/次，合并正丁醇液，用水洗3次，弃去水液，正丁醇蒸干，残渣加乙醇0.5 ml溶解，作为供试品溶液。按相同方法制备阴性对照溶液。
       
       照薄层色谱法［1］吸取上述溶液，点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上。以氯仿-醋酸乙酯-甲醇-甲酸（40∶5∶10∶0.2）为展开剂［7］，展开13 cm，取出，晾干。喷以5%香草醛硫酸试液，在105℃加热至斑点清晰。于日光下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的蓝紫色斑点，而阴性对照无此斑点。
       2.2  盐酸水苏碱含量测定
       2.2.1  对照品溶液的制备取经105℃干燥至恒重的盐酸水苏碱对照品适量，精密称定，加流动相溶解并稀释制成每毫升中含0.1 mg的溶液，即得。
       2.2.2  供试品溶液的制备取本品约1.5 g，精密称定，置索氏提取器中，加无水乙醇40 ml，加热回流8 h，提取液移至50 ml量瓶中，加无水乙醇至刻度，摇匀。精密量取10 ml至烧杯中，回收无水乙醇至干，残渣加流动相使溶解，加活性炭0.1  g（140℃干燥至4～5 h，备用），置沸水浴中加热0.5 min，边加热边搅拌，滤至10 ml量瓶中，用流动相5 ml分次洗涤烧杯和滤器，洗液并入同一量瓶中，用流动相定容至刻度，摇匀，即得。
       2.2.3  色谱条件的确定Spherisorb SCX（150mm×4.6mm）色谱柱，用阳离子交换树脂为填充剂；以磷酸二氢钠溶液（取磷酸二氢钠15.6 g，溶于1 000 ml水中，用磷酸调节pH3.5）为流动相；检测波长为194 nm；流速1.0 ml/min［8］。进样量为20 μl。
       2.2.4  系统适用性实验分别取盐酸水苏碱对照品溶液、八珍益母浓缩丸供试溶液，注入液相色谱仪，在上述色谱条件下，盐酸水苏碱峰形良好，无杂质峰干扰， 理论塔板数按盐酸水苏碱峰计算为858，保留时间为6 min左右；盐酸水苏碱色谱峰对照品的分离度为3.12，对称因子为1.21。
       2.2.5  标准曲线的制备精密称取盐酸水苏碱对照品适量，加甲醇制成每毫升含1 mg的盐酸水苏碱溶液，精密吸取此溶液1 μl，2 μl，3 μl，4 μl，6 μl，8 μl，按上述色谱条件依法进样后，记录峰面积。以峰面积为纵坐标，盐酸水苏碱量（μg）为横坐标绘制标准曲线，回归方程为Y=533 369X+60 637，r＝0.996 5，盐酸水苏碱在1.104～8.832 μg·ml-1范围内与峰面积有良好的线性关系。
       2.2.6  最低检测浓度按“标准曲线的制备”项下方法制备一系列低浓度的样品，进行分析，在信噪比S/N≥3时，最低检测限为11.04ng。
       2.2.7  重复性考察 取同一样品5份，每份约1.5 g，精密称定，按“含量测定”项下的方法分别制备供试品溶液，注入液相色谱仪，测定。供试品溶液中含盐酸水苏碱为3.339 mg/g，相对标准偏差为1.39%，重复性良好。
       2.2.8  精密度考察 取样品1.5 g，按含量测定方法项下制备供试品溶液，重复进样5次，测定峰面积。样品精密度良好，RSD值为0.89%。
       2.2.9  稳定性考察取样品1.5g，按供试品溶液的制备方法制备成供试品溶液，分别放置0，2，4，6，8，24 h，进样20 μl，按上述色谱条件测定峰面积。结果表明供试品溶液在24 h内稳定。
       2.2.10  回收率实验分别取本品5份 (含量为3.339 mg/g)，每份约0.75g，精密称定，依次分别加入盐酸水苏碱对照品溶液，分别注入液相色谱仪，记录峰面积，计算回收率。平均回收率为98.38%，RSD为0.24%。结果表明方法的准确度高。结果见表1。
       表1  回收率实验（略）
       2.2.11  样品含量测定取5批样品，按“供试品溶液的制备”依法操作，测定峰面积，计算样品含盐酸水苏碱的量分别为3.346，3.323，3.286，3.401 ，3.352 mg/g。结果见表2。
       表2  样品含量测定结果（略）
       3  讨论
       
       据文献报道，益母草含益母草碱、水苏碱等多种成分，水苏碱为其特有成分，且含量较大，因此选用水苏碱作为其鉴别对照物质。经本实验在相应于对照品盐酸水苏碱的斑点处，供试品中有此斑点，而阴性对照无此斑点，特异性好，故确定为益母草的鉴别和含量测定方法。
       
       《中国药典》（2005年版Ⅰ部）益母草口服液和益母草膏项下分别采用紫外-可见分光光度法和薄层色谱扫描法测定盐酸水苏碱含量，我们根据文献及对比研究，最后确定以高效液相色谱法测定制剂中盐酸水苏碱的含量。
       
       将按超声提取法制得的供试品溶液按“2.2.3”色谱条件测定，与我们拟定的索氏提取法制得的供试品溶液比较，所测得的盐酸水苏碱的相应峰值低得多，说明超声提取不能将颗粒剂中的盐酸水苏碱提取完全。此外，如采用无水乙醇回流提取也较索氏提取法低4～5倍，且重复性不好，故采用索氏提取法。关于提取时间，索氏提取8 h与8 h以上比较所得相应峰值无明显差异。在样品处理时我们发现提取液采用活性炭脱色能消除色素及制剂中辅料的干扰。
       
       实验中曾用紫外-可见分光光度法对盐酸水苏碱对照品溶液在150～700 nm波长范围内进行扫描测定，最大吸收波长在194 nm处，因此选择194 nm为检测波长。
       
       关于流动相pH的选择，根据文献报道，曾先后试验了磷酸二氢钠溶液（取磷酸二氢钠15.6 g，溶于1 000 ml水中，）用磷酸调节pH为5，4.5，4，3.5，3等，但以pH值为3.5时色谱分离最佳，与其它成分的色谱峰分离良好。
       【参考文献】
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