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       【摘要】 
       目的研究补肾健脾法对骨质疏松症大鼠骨组织形态学改变的影响。 方法取10月龄大鼠36只随机分成3组：补肾健脾组（BSJP）、正常组、模型组。BSJP组及模型组无菌条件下摘取双侧卵巢制造骨质疏松模型，正常组采取假手术。术后1周开始给药，12周后处死。取大鼠股骨远端1/3近关节部位,制作不脱钙骨切片,进行骨组织形态学研究。结果BSJP组大鼠静态组织学各项参数与模型组比较,有显著差异(P<0.01);动态组织学各项参数与模型组比较,有显著差异(P<0.01)。结论中医药补肾健脾法可以明显降低破骨细胞活性,抑制绝经后骨质疏松症的高转换率，能够有效地防治骨质疏松症。　
       【关键词】  补肾健脾； 骨质疏松； 骨组织形态学
       Effect of the Method of Bu Shen Jian Pi on Bone Histoncorphometry in Osteoporosis Rats
       TANG Yanfeng， CHEN Jiuyi*，LI Yuxiong，LUO Yonghong，LI Xiping，XU Yuankun
       （Traditional and Chinese College of Guiyang,Guizhou,Guiyang 550002,China;No.1 Hospital Attached to Guiyang College of TCM,Guizhou,Guiyang 550002,China）
       Abstract：ObjectiveTo study the effect of the method of Bu Shen Jian Pi on bone histoncorphometry in osteoporosis rats. MethodsThirty six rats aged 10 months were randomly divided into three groups:Bu Shen Jian Pi(BSJP) group,viod group and model group .The BSJP and model groups were performed ovariectomy on both sides,the void group rats were shamly operated. After one week  the medicines were given and the rats were killed 12 weeks later.1/3 quarters of femoral near the joint were taken to investigate the histoncorphometry of bone. ResultsThe static and dynamic histoncorphometric parameters in BSJP group had significant difference as compared with model group(P<0.01).ConclusionThe method of Bu Shen Jian Pi can inhibit the activity of osteoclastic clearly ,and inhibit the high switch rate of bone after menopause.
       Key words：Bu Shen Jian Pi；  Osteoporosis；  Tectology 
       
       骨质疏松症（Osteoporosis,OP）是一种以骨量降低和骨组织微结构破坏为特征，导致骨脆性增加和易发生骨折的全身性疾病，分为原发性骨质疏松症和继发性骨质疏松症，绝经后骨质疏松症属于原发性骨质疏松，为高转换型。中医“骨痿”与现代意义的骨质疏松概念基本相似。就病因病机而言，历代医家多从“肾主骨”“肾藏精，主骨生髓”等方面出发，认为与“肾虚”有关。但是肾为先天之本，脾为后天之本，脾主运化，充养肾精，即所谓：“肾之合骨也，其荣在发，其主脾也”（《素问·五脏生成篇》），若脾虚，肾失所养，进一步可导致肾虚，从而使骨髓失养而致骨痿，可见中医脾肾二脏在防治骨质疏松症中的重要性。本实验以摘取双侧卵巢的大鼠为模型，从骨组织形态学方面观察补肾健脾法防治骨质疏松症的作用机理，为中医药防治骨质疏松症提供理论依据。
       1  材料与方法
       1.1  动物取36只10月龄Wistar雌性大鼠，体重（200±50）g［由贵阳医学院实验动物中心提供，许可证号：SCXK（黔）2002－0001］。随机分为3组：补肾健脾（BSJP）组、正常组、模型组，每组12只。
       1.2  试剂与仪器甲基丙烯酸甲酯（MMA，500 ml），北京新光化学试剂厂生产；邻苯二甲酸二丁酯（500 ml），浙江杭州临平化工厂生产；过氧化苯甲酰（500 g），上海中利化工厂生产；氢氧化钠（500 g），广州市化学试剂公司生产；无水乙醇（500 ml），成都金山化学试剂有限公司产品；四环素（5ml）由北京天根生物有限公司提供；甲苯胺蓝（25 g），由上海化学试剂厂生产。电动搅拌机（99－1），金坛市富化仪器有限公司生产；荧光图象分析系统（LEICA DM2500）德国Leica公司产品；重型硬质切片机（MOD.K），西德产；电子天平（EL104）梅特勒－托利多仪器（上海）有限公司产品。
       1.3  动物造模将补肾健脾（BSJP）组与模型组动物用7％水合氯醛300 mg/kg腹腔注射，麻醉生效后沿后正中线切开皮肤约1.5～2 cm，肋弓下脊柱旁开1 cm处切开肌肉，打开后腹膜即可见到位于肾脏后下方的脂肪团，将其轻柔提出，找到粉红色的卵巢，分离其周围脂肪，用4号丝线结扎其下方的输卵管血管［1］。将卵巢完整取出，放入固定液固定。取出双侧卵巢后逐层缝合，以600万 u/100 ml青霉素注射于手术处，每侧1ml。正常对照组行假手术，仅取卵巢旁的部分脂肪即可关闭伤口。术后青霉素肌注6万 u/只，1次/d，连续3 d。每组取3个卵巢标本行病理切片，常规HE染色，确保为完整卵巢组织。
       1.4  动物用药造模成功后适应性饲养1周。BSJP组给予补肾健脾方（中药由贵阳中医学院第一附属医院提供）水煎剂，15 ml/kg，1次/d。每4周后停用1 d，重新称量体重调整用药量。模型组及正常对照组灌服蒸馏水，15 ml/kg，1次/d。
       1.5  标本采集每组动物处死前用四环素进行标记，40 mg/(kg·d)。首次在处死前第9天给药，第2次在处死前第3天给药。四环素标记后将大鼠用7％的水合氯醛300 mg/Kg进行腹腔内注射，麻醉生效后无菌条件下取出一侧股骨下端近关节段，将周围软组织剔除干净，立即放入40％酒精中固定，置于4℃冰箱。标本采取后将动物拉颈处死。
       1.6  不脱钙骨切片的制作［2］①固定：标本采取后立即固定于40％酒精中，保存于4℃冰箱中。固定24 h；②脱水：固定后以40％，70％，80％，95％，100％乙醇系列脱水各2次，24 h/次；③透明：于二甲苯中透明24 h；④渗透：将透明过的标本依次入MMAⅠ液、MMAⅡ液、MMAⅢ液进行渗透，48 h/次；⑤包埋：在适中的包埋器在中，将骨标本浸于新鲜配置的包埋液中，置包埋器于40℃恒温箱中12 h，然后置于室温下直至包埋液硬化。放于4℃冰箱内保存；⑥切片：修整包埋标本块用重型切片机切片。切片时用40％酒精湿润刀面及组织切面。切制5～7 μm切片以观察细胞结构，15～20 μm于荧光下测量四环素标记的数据。将载玻片于50℃的贴片液中浸数分钟，然后于50℃恒温箱中烘干。在处理过的载玻片上滴数滴95％酒精，放上切片，用眼科镊小心展开，覆以一张薄纸，压紧切片，用夹子夹紧放置于37℃恒温箱中烘干；⑦染色：切片依次入MMAⅠ液、Ⅱ液进行脱塑，各10 min；下行酒精：依次入无水酒精，95％酒精，90％酒精，80％酒精，70％酒精，每级2 min；蒸馏水浸洗数分钟；甲苯胺蓝液中染色30 min；缓冲液中冲洗2次，1 min/次。用滤纸洗干切片，入无水酒精脱水2次，1 min/次。二甲苯透明2次，1 min/次。切片凉干后用贴片液封固。染色结果：矿化骨组织呈深蓝至深紫色，类骨质呈浅蓝色，矿化前缘呈深紫色，粘合线呈浅蓝色，破骨细胞呈浅蓝色，软骨基质呈异染紫色。
       1.7  指标检测
       1.7.1  指标内容①骨小梁骨样组织体积（trabeculan osteaid volume,TOV）:表示松质骨空间体积内所含骨样组织的体积百分数，是衡量骨量水平的主要指标；②骨小梁成骨细胞表面（trabecular osteoblastic surface,TOBS）:骨样组织表面覆盖着成骨细胞表面占骨小梁表面的百分数；③骨小梁破骨细胞吸收表面（trabecular osteoclastic resorption surface,TORS）:破骨细胞正在吸收及吸收完成破骨细胞已经消失而成骨细胞尚未出现的表面占骨小梁总体积的百分数；以上3个指标表示静态组织学改变；④骨小梁四环素双标表面（double labeled surface,DLS）：四环素双标荧光表面长占骨小梁表面总长的百分数；⑤骨小梁四环素单标表面（single labeled surfaces,SLS）：四环素单标荧光表面长占骨小梁表面总长的百分数；⑥矿化率（mineralization rate,MA）:四环素双标线之间的平均距离除以两次标记之间相隔天数［3］。以上3个参数表示动态组织形态学改变。
       1.7.2  检测方法由于标本制作有的不理想，每组选择8个标本进行比较。将所制不脱钙骨切片于荧光显微镜下观察，运用LeicaFW4000图象分析软件进行图象分析，得出各个参数的数据并进行计算。
       1.8  统计方法各组数据均用±s表示，用SPSS10.0统计软件进行统计学处理，采用t检验比较各组间差异性。
       2  结果
       2.1  各组间静态组织学变化见表1。
       表1  大鼠骨组织静态组织形态学的变化（略） 
       TOV值：※与﹡比较，P<0.01；﹟与﹡比较，P<0.01,；TOBS值：※与﹡比较，P<0.05;﹟与﹡比较，P<0.05,；TORS值：※与﹡比较，P<0.01; ﹟与﹡比较，P<0.01；n=8
       2.2  各组间动态组织形态学改变比较见表2。
       3  讨论
       
       绝经后骨质疏松的发生是由于机体雌激素水平下降，促黄体素和促卵泡素水平上升［1］，骨代谢发生异常改变，破骨细胞骨吸收活动加速，骨无机盐和有机质丢失增加，而成骨细胞骨形成功能并未因卵巢切除而受到抑制，反而代偿性增强为高转换型骨代谢，从而造成骨密度下降，骨组织形态学及超微结构遭到破坏，导致骨生物力学性能下降［2］。
       表2  大鼠骨组织动态组织形态学的变化（略）
       SLS值：※与﹡比较，P<0.01，﹟与﹡比较，P<0.05；DLS值：※与﹡比较，P<0.01，﹟与﹡比较，P<0.01；MA值：※与﹡比较，P<0.01，﹟与﹡比较，P<0.05；n=8
       
       为了更好地模拟人类的绝经后骨质疏松症，本实验采取去势大鼠为动物模型。去势大鼠动物模型于1969年由Saville首先建立，后被反复证实，成为研究骨质疏松的典型模型。该模型造模因素单一，周期短、模型确认重复性好。用去势大鼠建立的骨质疏松症动物模型，在研究中发现动物下丘脑－垂体－性腺轴功能紊乱，雌激素水平下降，促黄体素和促卵泡素水平上升，与人类绝经后骨质疏松症的病理表现相似。对于大鼠月龄，一般采取10月龄，此时动物处于中年后期，趋向于类似女子天癸竭、地道不通的年龄阶段及机体状态，在摘除性腺3个月后，模型鼠年龄已达13月，进入中老年，这既与中医肾虚病理实质相符，也与现代医学对原发性骨质疏松症的认识一致［3］。因此本实验选用10月龄Wistar大鼠进行造模。据本实验结果，模型组动态组织学参数与正常组比较（P<0.01），有显著差异，表明取除卵巢后大鼠机体骨代谢处于高转换状态。从静态学指标来看，模型组骨小梁成骨细胞表面及骨小梁破骨细胞吸收表面与正常组比较（P<0.01），有显著差异，证明本实验动物造模是成功的，符合绝经后高转换状态。
       
       中医药治疗骨质疏松症临床上多以补肾为主要治疗原则，“肾主骨”，补肾可以强壮筋骨［4］。但从中医基础理论出发，脾肾二脏关系密切，乃“先天”与“后天”的密不可分的关系。脾主运化，充养肾精，即所谓：“肾之合骨也，其荣在发，其主脾也”（《素问·五脏生成篇》），若脾虚，肾失所养，进一步可导致肾虚，从而使骨髓失养而致骨痿。《素问·本神篇》云：“脾藏营，营舍意，脾气虚则四肢不用，五脏不安”，又《素问·太阴阳明论》说：“四肢皆禀气于胃，而不得至经，必因于脾乃当得禀也”等说明了四肢的功能正常与否与脾之运化功能有密切关系。另外，“脾主身之肌肉”（《素问·痿论》），肌肉丰满壮实乃骨骼强壮的力学保证。若脾气虚弱，运化不力，脾精不足，则肾精乏源，而致骨痿；脾气虚弱，中阳不振，气血不足，津液不布，肌肉消瘦，倦怠乏力，肢体痿弱不用而致骨痿，即现代所谓的骨质疏松症［5］。可见“脾”在骨质疏松症防治中的重要作用。
       
       本实验通过补肾与健脾并重，以黔淫羊藿与怀山药为君药，同时配以补肾、健脾、活血中药，以补肾健脾活血为治疗指导原则，观察补肾健脾法对骨质疏松症大鼠组织形态学改变的影响。补肾可以强壮筋骨，健脾可以补养气血丰养肌肉，活血可使气血通畅，三者并用则使骨有所强，骨有所动，从而阻止了骨质疏松症的进展。本实验补肾健脾组分别与正常组和模型组比较，在抑制破骨细胞活性，阻止骨吸收方面作用明显，抑制了去卵巢大鼠的骨代谢高转换状态。通过本实验进一步丰富了中医药在治疗骨质疏松症上的理论基础，为临床用药提供了理论依据，进一步推动中药新药的研发。
       【参考文献】
         　　［1］ 石 岩，梅世昌.医学动物实验实用手册，第1版［M］.北京：中国农业出版社，2002：12.
       
       ［2］ 沈 霖，林燕萍，王拥军.骨伤科实验研究，第1版［M］.北京：北京科学技术出版社，2005：8.
       
       ［3］ 王和鸣，丁建中，周临东.骨伤科基础研究，第1版［M］. 北京：北京科学技术出版社，2005：8.
       
       ［4］ 孔月晴，王新江.骨质疏松证治及肾主骨理论的科学性［J］.中国医药学刊，2004，22(4)：636.
       
       ［5］ 邓奉承，杨钦河.脾胃学说在骨伤科临床中的应用［J］.时珍国医国药，2006，17（6）：1064.