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       【摘要】 
       目的探讨复方丹参对家兔骨折愈合肾组织转化生长因子（TGF-β1）表达的影响。方法36只雄性家兔，造成桡骨骨折缺损动物模型，随机分成模型组、复方丹参组、伤科接骨片组。于骨折后21 d与35 d用免疫组化的方法分别观察肾脏TGF-β1表达的情况。结果骨折后21 d的复方丹参组和伤科接骨片组TGF-β1的表达均高于模型组(P<0.05)，但在骨折后35 d无明显差别。结论复方丹参可能是通过增加TGF-β1的表达而促进骨折愈合。
       【关键词】  骨折 丹参 肾组织转化生长因子 家兔
       复方丹参是由丹参、淫羊藿、白术、黄芪组成的复方，具有益气养血、补肾填精、祛瘀止痛、活血通经作用。实验发现复方丹参可以促进家兔骨折中期骨愈合（另文待发表），故采用免疫组化技术，利用计算机真彩色图像分析系统观察其对肾组织转化生长因子（TGF-β1）表达的影响，进一步探讨复方丹参促进骨折愈合的可能机制。
       1  器材
       1.1  动物36只雄性新西兰兔（由广州中医药大学实验动物中心提供），体重为2～2.5 kg，普通级，使用标准饲料（由广州中医药大学实验动物中心提供）。
       1.2  药品及试剂复方丹参是由丹参、淫羊藿、白术、黄芪组成的复方，由广东医学院开发中心提供。TGF-β1组织化学试剂盒，由武汉博士德生物工程公司提供。
       2  方法
       2.1  实验设计与分组36只雄性新西兰兔，全部造成右侧桡骨中下1/3旋前圆肌止点处3 mm缺损的骨折模型后，然后按体重随机分为3组，每组12只，实验分组见表1。
       
       各组家兔在造模后21 d，35 d时，每组处死6只，分别留取肾脏。
       2.2  骨折模型的制备方法戊巴比妥钠30 mg/kg耳缘静脉麻醉家兔后，去毛、消毒手术野、铺无菌巾，在右侧前肢中下段前内侧作纵形切口，逐层切开皮肤、皮下组织，钝性分离肌肉组织，在桡骨中下1/3旋前圆肌止点3 mm用牙科电钻作3 mm缺损，保留尺骨完整，缝合皮肤。手术留取骨标本，术后包扎，以夹板固定，造模即日起每只肌注青霉素40万单位/d，连续3 d，5 d后拆除皮肤缝线。
       表1  实验设计与分组（略）
       2.3  免疫组织化学染色肾组织固定后，经常规酒精脱水，石蜡包埋，制成4 μm切片，37℃恒温箱过夜。SABC法检测TGF-β1，切片脱蜡至水，依次经3%H2O2室温15 min，复合消化液室温10 min，正常血清封闭液37℃ 30 min，兔抗TGF-β1多克隆抗体（1∶150）4℃过夜；生物素化羊抗兔IgG 37℃ 30 min，SABC试剂 37℃ 30 min；DAB显色，苏木精复染；脱水、透明、封片；用磷酸缓冲液PBS代替一抗作为阴性对照，用试剂盒内阳性切片作阳性对照。
       2.4   免疫组织化学结果判断及图像分析以肾小管间质细胞浆内有棕黄色颗粒为阳性。将免疫组化切片置OLYMPUS显微镜下（400×），对所测视野进行准确定位后由摄像系统提取数值化细胞图像输入HPIAS-2000多媒体彩色病理图像分析系统进行处理，每例随机选取8个完整而不重叠的视野进行定量分析，以TGF-β1蛋白免疫组化反应阳性颗粒的平均光密度和阳性颗粒面积与视野面积的比率来反映肾组织TGF-β1的表达水平。
       2.5  统计学处理所有数据用±s表示，用SPSS11.5软件进行分析，以P<0.05表示具有统计学意义。
       
       3  结果
       3.1  复方丹参对家兔骨折后21 d肾组织TGF-β1表达的影响由表2和图1～3的结果可见，复方丹参组和伤科接骨片组TGF-β1表达的染色强度和阳性面积比率均高于模型组(P<0.05)，提示复方丹参和伤科接骨可以增加家兔骨折中期TGF-β1的表达。
       表2  复方丹参对家兔骨折后21 d肾组织TGF-β1表达的影响（略）
       图1  模型组家兔骨折后21 d  肾组织TGF-β1免疫组化染色结果 （400×） （略）       
       图2  复方丹参组家兔骨折后21 d肾组织TGF-β1免疫组化染色结果 （400×）  （略）    
       
       3.2  复方丹参对家兔骨折后35 d肾组织TGF-β1表达的影响由表3和图4～6的结果可见，复方丹参组和伤科接骨片组TGF-β1表达的染色强度和阳性面积比率均与模型组无差别(P>0.05)。提示复方丹参和伤科接骨不影响家兔骨折后期TGF-β1的表达。
       表3  复方丹参对家兔骨折35 d肾组织TGF-β1表达的影响（略）
       图3  伤科接骨片组家兔骨折后21 d肾组织TGF-β1免疫组化染色结果 （400×）（略）       
       图4  模型组骨折术后35 d肾组织TGF-β1免疫组化染色结果（400×）  （略）
       图5  复方丹参组骨折术后35 d肾组织TGF-β1免疫组化染色结果（400×）（略）        
       图6  伤科接骨片组骨折术后35 d肾组织TGF-β1免疫组化染色结果（400×） （略）
          
       4  讨论
       
       骨形态计量学结果显示，复方丹参可以促进家兔骨折中期骨愈合，但对骨折愈合后期无影响（另文待发表）。而免疫组化的结果显示，在骨折愈合的中期(骨折后21 d)，复方丹参可以促进TGF-β1的表达，对骨折愈合的后期(骨折后35 d) TGF-β1的表达无明显影响。两者的结果相一致，提示复方丹参可能是通过增加TGF-β1的表达而促进家兔骨折中期骨愈合。
       
       转化生长因子(TGF-β1)广泛分布于血小板、巨噬细胞及肾脏组织，是一种具有双向调节作用的生长因子，主要表现促进成骨细胞增殖和分化，它还可以通过刺激或抑制其他细胞因子的产生或调控其作用来控制骨的修复和重建［1］。复方丹参是由丹参、淫羊藿、白术、黄芪组成的复方，可以促进骨形成和抑制骨吸收，对大鼠糖皮质激素性骨质疏松有明显的预防作用［2］。实验研究显示丹参能促进成骨细胞样细胞成熟，分泌胶原性物质和碱性磷酸酶，并使钙盐在胶原基质上沉淀，形成骨小结节，而丹参的有效部位(RS9403)可能通过TGF-R这类生长因子的影响促进骨折的愈合［3］。文献报道［4］，在骨折愈合的早、中期(骨折后14，24 d)，淫羊藿促进了TGF-β1的表达。淫羊藿还可能通过 TGF-β1促进破骨细胞的形成而促进骨痂的改建及髓腔的再通，促进了整个骨折愈合过程。
       【参考文献】
         　　［1］ 姬洪全，党耕町. 转化生长因子β的生物学效应及其在骨折愈合过程中的作用［J］.中华外科杂志，1998，36(8): 500.
       
       ［2］ 邹丽宜，吴 铁，崔 燎，等. 复方丹参制剂对糖皮质激素性骨质疏松症大鼠的防治作用［J］.中国临床康复,2005,9(11): 236.
       
       ［3］ 史炜编，符诗聪，杜 宁，等．丹参有效部位对骨折愈合过程中胶原基因表达的影响［J］.中国中西医结合杂志，2000，20(4)：269.
       
       ［4］ 刘道德，王 凡. 淫羊藿对家兔骨折愈合过程中VEGF及TGF-β1表达的影响［J］.实用医院临床杂志，2006，3(3):30.