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       【摘要】 
       目的研究佛手种质资源多样性和遗传关系。方法采用随机扩增多态性随机扩增多态性DNA（RAPD）技术分析了佛手13份种质材料的亲缘关系。结果从110条引物中筛选出16条多态性高的引物，共扩增出185条DNA带，其中多态性带有168条，多态率为90.8%。通过聚类分析，在相似系数0.67的水平上将13份材料分为3类。结论佛手种质间存在较丰富的遗传多样性，聚类结果与以产地为依据对佛手进行品种类群划分较为一致。
       【关键词】  佛手 随机扩增多态度性DNA分析 遗传多样性
       佛手Citrus medica L. var. sarcodactylis (Noot.) Swingle(CMS)为芸香科柑桔属植物，其干燥果实入药，具有舒肝理气、和胃止痛的功效［1］。佛手悠久的栽培历史，形成了一些各具特色的地方品种，药材现行规格按产地主要分为广佛手、川佛手和浙佛手［2］。目前，有关佛手种质资源的研究很少，对其种质资源的多样性和遗传结构缺乏系统的研究。随机性扩增多态性DNA（RAPD）技术是20世纪90年代发展起来的一种快速便捷的分子标记技术，已被证明是研究植物遗传多样性及种质鉴定的有效手段，广泛应用于药用植物种内、种间及近缘属间系统学研究［3～5］。本文拟采用RAPD技术分析佛手不同产地、不同栽培品种的亲缘关系及遗传多样性，旨在探究其基因组上的差异，为佛手种质资源的评价和育种提供分子依据。
       1  器材和方法
       1.1  材料佛手Citrus medica L. var. sarcodactylis (Noot.) Swingle(CMS)的叶片，经广州中医药大学鉴定教研室张丹雁教授鉴定。样品来源见表1。
       1.2  仪器与试剂Beckman -15CSR冷冻高速离心机； PCR仪(Applied Biosystems 2720 Thermal cycler)；UVP GDS7600型凝胶成像仪；ECAN Spectra FLUOR plus多功能酶标仪。大连宝生物DR001AM PCR扩增试剂盒；上海生工随机引物；上海生工进口分装琼脂糖；上海申能博彩3 s柱离心式植物基因组DNA试剂盒；天为时代DNA Marker(200 bp DNA Ladder plus)；其他试剂均为国产分析纯试剂。
       表1  样品来源（略）
       1.3  方法
       1.3.1  佛手总DNA的提取和检测采用上海申能博彩公司的3s柱离心式植物基因组DNA试剂盒提取。将提取到的DNA用纯水稀释10倍后，用酶标仪分别测定其在260，280 nm处的吸收值，计算出OD260与OD280的比值及DNA浓度，并以1.5%琼脂糖凝胶电泳观察提取结果的优劣。
       1.3.2  佛手RAPD反应体系和扩增程序在对佛手PCR扩增体系优化后，确定反应的总体积为25 μl ，包括： MgCl2 2 μl (25 mmol/L )，引物1.5 μl(10 μmol/L)， dNTPs 2μl （2 mmol/L），10×buffer缓冲液3 μl，0.3 μl Taq酶（5 U/μl），60 ngDNA样品。
       
       PCR扩增程序为：94℃预变性4 min，94℃变性1 min,35℃退火l min, 72℃延伸1.5 min，40次循环，最后72℃延伸10 min，－20℃保存。
       1.3.3  引物筛选选取德庆、青衣童子两种地理位置差异较大的DNA样品做模板，用110个引物(S1～S100, S220～S229) 对其进行PCR扩增筛选。
       1.3.4  扩增与产物检测13个佛手DNA样品作为扩增模板，用筛选的引物及条件进行RAPD反应，扩增产物经电泳、染色后在凝胶分子成像仪上检测并拍照记录。
       1.3.5  数据分析将电泳图谱上清晰且可重复出现的条带记为“1”，同一位置没有出现条带的记为“0”，从而生成由“1”和“0”组成RAPD表型数据矩阵。统计每条引物扩增出的总带数和多态性带数，计算多态性位点百分率p=(k/n)×100%（其中k是多态位点数目；n为所测位点总数）。利用NTSYSpc-2.10e求出Nei-Li相似系数矩阵，用UPGMA法对其进行聚类分析。
       2  结果
       2.1  引物筛选110个引物中有51条引物扩增出条带，每条引物扩增带数1～15条，平均6条，扩增的谱带分子量大小在300～2 200 bp，16条引物扩增的多态性带相对较多，且条带清晰、重复性好。
       2.2  扩增产物的多态性分析以16个10 mer引物对供试的13份材料进行PCR扩增，统计结果见表2。16个引物共扩增出185条带，其中多态性带有168条，占90.8%；平均每个引物可扩增出11.6条带，平均每份材料可扩增出14.2条带，扩增的谱带分子量大小在300～2 200 bp；各个引物间扩增的位点数相差较大，不同引物的扩增带数变幅从6～15条不等，其中扩增带数最多的引物为S23，具15条扩增带，最少的为引物S6，仅具6条扩增带，说明不同引物与供试材料总基因组DNA部分区域的同源性具有较大的差异。部分引物的扩增结果见图1。
       表2  16个引物的扩增结果（略）
       2.3  聚类分析13份供试材料的Nei遗传相似系数矩阵如表3所示，经聚类分析构建亲缘关系树状图（图2）。相似系数分布在0.58～0.89之间，说明佛手种质的遗传多样性较为丰富。供试材料在相似系数为0.67处分为3个类群，第1类群包括Sn1，Sn2，Sn3和Sn4，第2类群包括Sn5，Sn6，Sn7和Sn8，第3类群包括Sn9，Sn10，Sn11，Sn12和Sn13。
       表3  13份佛手种质资源的相似系数矩阵（略）
       图中对应的各个泳道的品种顺序相同，从左到右依次为Sn1～Sn8，DNA Marker(200bp DNA Ladder plus)，Sn9～Sn13，阴性对照
       图1  引物S24，S31，S80，S220的RAPD扩增图谱（略）
       3  讨论
       
       本研究应用RAPD技术对佛手种间亲缘关系进行了阐明，来源不同的13份种质的遗传多样性高达90.8%，表明佛手现有的种质遗传变异较大，从而构成了较为丰富的种质资源基因库，说明佛手遗传基础广，具有较大的育种潜力和较强的进化能力，这与佛手栽培历史悠久和种植范围较广有关。
       图2  基于RAPD分析产生的佛手种质资源聚类图（略）
           
       供试材料在相似系数为0.67处分为3个类群，这与按照产地的不同将佛手分为广佛手、浙佛手和川佛手的划分一致。第1类群和第3类群中各种质之间的亲缘较近，这与它们在植物学形态上差异不大的情况相吻合。第2类群中4个栽培品种虽然在植物学形态上差异较大，但由于生长环境相同，在相似系数0.75处聚为一类，亲缘关系也较近，可能是遗传基因和环境相互作用的结果；其中，Sn8为Sn5的芽变选育品种，两者在形态上有较大的差异，但分子水平上证明其遗传关系较近；Sn6和Sn7两者在叶片、花、果等植物学形态上差异较大，但其相似系数为0.78，表明其亲缘关系较近，形态上的差异并未在分子水平上反映。第3类群中，Sn9（泸州开手果）与Sn10（泸州拳手果）代表佛手的两种不同果型，以前通常按果型将佛手分为两种农家品种，但笔者在实地调查中发现，目前开手与拳手果型的分化不明显，同一树上经常会出现两种果型，而且春果一般为开手型，夏果一般为拳手型，表明佛手在长期的自然演化中，果型已出现了混杂，果型的差异并不能说明其遗传距离的远近。
       【参考文献】
         　　［1］ 国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社，2005：124.
       
       ［2］ 肖培根.新编中药志，第2卷［M］.北京：化学工业出版社，2002：304.
       
       ［3］ 左志锐，穆 鼎，高俊平，等.百合遗传多样性及亲缘关系的RAPD分析［J］.园艺学报，2005，32(3)：468.
       
       ［4］ 周利杰，李南高，虞 泓，等.云南灯盏花遗传变异的RAPD分析［J］.云南植物研究，2005，27(1)：59.
       
       ［5］ 丁 鸽，丁小余，沈 洁，等.铁皮石斛野生居群遗传多样性的RAPD分析与鉴别［J］.药学学报，2005,40(11):1028.