文章标题 全文   多个检索词，请用空格间隔。

       【摘要】 
       目的检测异常黑胆质成熟剂中总黄酮和总酚的含量。 方法以芦丁为对照品，采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法测定了总黄酮含量；以没食子酸为对照品，采用Folin-Ciocalteu比色法测定了总酚含量。结果芦丁浓度在0.011～0.130 mg/ml范围内线性关系良好，最低检测限为0.06 μg/ml，最低定量限为0.18 μg/ml。该方法加样回收率为95.1%～97.5%，精密度为1.34%，水提物和醇提物中总黄酮含量分别为16.2 mg/g和19.0 mg/g。没食子酸浓度在1.1～7.7 μg/ml范围内线性关系良好，最低检测限为0.01μg/ml，最低定量限为0.03 μg/ml。该方法加样回收率为99.5%～104.8%，精密度为3.39%，水提物和醇提物中总酚含量分别为38.28 mg/g和21.54 mg/g。结论此两种方法灵敏、准确性强，精密度高，重复性好，分别可以用作异常黑胆质成熟剂中总黄酮和总酚含量的测定。
       【关键词】  异常黑胆质成熟剂 总黄酮 总酚 含量测定
       异常黑胆质成熟剂是维吾尔医常用复方制剂，由破布木Cordia dichotoma Forst.，红枣Ziziphus jujuba Mill.，甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.，牛舌草Anchusa italica Retz.，小茴香Foeniculum vulgare Mill.，地锦草Euphorbia humifusa Willd.等药材组成,用于治疗由异常黑胆质所导致的肿瘤、糖尿病和心血管疾病等。现代研究已证实，异常黑胆质成熟剂可清除自由基、提高患者抗氧化功能、保护羟自由基引发的DNA氧化损伤和线粒体氧化损伤等，具有较强的抑制HepG2细胞体外生长、抑制HepG2细胞DNA、RNA和蛋白质生物合成等作用。以往的研究结果还表明，异常黑胆质成熟剂的总黄酮部位能明显抑制癌细胞生长、诱导癌细胞凋亡及调控凋亡基因表达等［1～3］。研究报道破布木、地锦草、甘草、牛舌草等含丰富的黄酮类化合物外，还含有其他非黄酮类多酚化合物［4～7］。本文采用分光光度法对异常黑胆质成熟剂水提物总黄酮及总酚含量测定的方法进行了系统研究。现报道如下。
       1  器材
       1.1  药材 组成异常黑胆质成熟剂复方制剂的每味药材均购自新疆维吾尔医医院制剂中心，并由该中心鉴定。
       1.2  仪器 Cintra 40紫外可见分光光度计(澳大利亚GBC科学仪器公司)；Sartorius BS110S精密电子天平（德国Sartorius）；旋涡振荡器；离心机。
       1.3  试剂 芦丁标准品购自中国药品生物制品鉴定所，批号为0080-9705；没食子酸购自天津市光复精细化工研究所，批号为20060508；其它试剂均为A.R 级。
       2  方法与结果
       2.1  总黄酮的测定 
       2.1.1  样品溶液的制备   精密称取异常黑胆质成熟剂干燥粉末0.5 g，置10 ml具塞试管中，加入4 ml沸水，搅拌，充分溶解后加入无水乙醇6 ml，置于漩涡振荡器上振荡3 min，4 000 r/min离心5 min，取上清液；沉淀物再加沸水4 ml，搅拌，充分溶解后加入无水乙醇6 ml，置于漩涡振荡器上振荡3 min，4 000 r/min离心5 min，取上清液；两次上清液合并，置于25 ml容量瓶中，加60%乙醇至刻度，备用。
       2.1.2  对照品溶液的配制   精确称取已烘干至恒重的芦丁标准品（纯度≥98%）18.6 mg，置于50 ml容量瓶中，用60%乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液（每毫升含无水芦丁0.372 mg）。
       2.1.3  氢氧化钠溶液及乙醇用量的选择  本实验室用比色法进行异常黑胆质成熟剂水提物中黄酮含量测定时发现若按照常规的比色法进行测定样品溶液中会出现一些随时间延长逐渐增多的红色絮状的漂浮物，造成吸光度显著波动，影响测定结果的稳定性、准确性和重复性，发现仅含相同浓度显色试剂和乙醇的空白溶液同样有絮状物(白色)存在，因此可以认为这种现象是由溶液中氢氧化钠、水和乙醇三元体系不适当配比所造成，而不是样品中含有的干扰性杂质引起，这种在乙醇的盐析作用下析出的氢氧化钠絮状物因孔隙多具有很强的吸附能力，将溶液中的有色物质吸附在其表面上，从而产生红色絮状的漂流物，造成总黄酮浓度的测定结果偏高且不稳定。通过将4%氢氧化钠溶液的用量从4 ml减到2  ml并选择水作为补充溶剂，彻底排除了红色絮状物，大大改善了总黄酮测定方法的稳定性和准确度（见图1）。实验结果还表明，氢氧化钠溶液新调整的用量仍为过量，完全可以确保黄酮类成分充分反应。
       2.1.4  测定波长的选择精密吸取对照品溶液1.0和0.0 ml及供试品溶液1.0，1.0和1.0 ml，分别置10 ml量瓶中，5份溶液分别标记为1，2，3，4，5号，按表1和表2定量加入水和/或显色剂，注意控制显色试剂加入时间：加入5%NaNO2 0.3 ml，摇匀,放置6min;分别加入10%Al(NO3)3 0.3 ml，摇匀，放置6 min；再分别加入4%NaOH溶液2 ml，最后用蒸馏水分别稀释至刻度, 摇匀。不加显色试剂的以等量水来代替，以使溶液含醇量始终保持不变。
       
       然后在可见紫外分光光度计上在300～600 nm波长范围内，以2号溶液作为空白对照，对3，4和5号溶液进行扫描，分别绘制待测溶液的3种吸收光谱图。见图2。
       
       图2表明，样品在此波长处却无明显吸收峰。但已被显色的待测溶液（样品3）与未加入硝酸铝溶液的样品溶液(样品2)在510 nm波长处的吸光度之差ΔA值最大，因此，以5号溶液为空白，在400～600 nm波长范围内对4号溶液进行扫描，得样品溶液的吸收光谱图(Munziq)。与芦丁溶液显色之后的吸收光谱图(Rutin，以1号溶液为空白，对2号溶液进行波长扫描)绘制在同一坐标上，得图3。
       
       由图3确定，在510 nm处，对照品和样品有共同的最大吸收峰，因此，我们以510 nm作为测定波长。对照品测定时，以 1号溶液为空白，测定2号溶液的吸光度；供试品测定时，以5号溶液为空白，测定4号溶液的吸光度。
       2.1.5  标准曲线的制备分别精密吸取对照品溶液0，0.3，0.5，1.0，2.0，3.0，3.5 ml标准品溶液分别置于10 ml容量瓶中,接着向容量瓶中依次加入4.7，4.5，4.0，3.0，2.0，1.5 ml蒸馏水,使各容量瓶中的溶液总体积均变成5 ml，加入5%NaNO2 0.3ml，摇匀，放置6 min；分别加入10% Al(NO3)3 0.3 ml， 摇匀，放置6 min；再分别加入1 mol/L NaOH溶液2 ml，最后用蒸馏水分别稀释至刻度, 摇匀。以第1瓶溶液作为空白参照,分别在分光光度计上测A510。结果见表3。
       表1  1号和2号溶液的组成ml（略）
       表2  3～5号溶液的组成ml（略）
       图1  改进前后的吸光度动力学测量曲线比较（略）
       图2  待测溶液的吸收光谱图（略）
       图3  样品与芦丁溶液的吸收光谱图比较（略）
       表3  不同浓度芦丁的吸光度及LOD，LOQ值（略）
       实验结果表明，芦丁浓度在0.011～0.130 mg/ml范围内线性关系良好。得回归方程：A= 11.356C-0.008，相关系数r=0.999 9。最低检测限为0.06 μg/ml，最低定量限为0.18 μg/ml。
       2.1.6  加样回收率实验精密量取同一批已知浓度的样品溶液5份，每份1.0  ml，分别加入芦丁标准品溶液0.2，0.4，0.7，1.0和1.5 ml，分别按“2.1.5 标准曲线的制备”项下方法显色后，以各自不含10%Al(NO3)3的溶液作为空白对照，进行含量测定，重复3次，并计算回收率。
       表4  供试品溶液的加样回收率（略）
       结果表明，该方法加样回收率为95.1%～97.5%。
       2.1.7  精密度实验精密量取同一批已知浓度的样品溶液5份，每份1.0 ml，分别按“2.1.5 标准曲线的制备”项下方法显色后，以各自不含10% Al(NO3)3的溶液为空白对照，进行含量测定。结果见表5。
       
       结果表明，该方法加样回收率为95.1%～97.5%。
       表5  供试品溶液的精密度（略）
       结果表明，该方法精密度小于2%。
       2.1.8  异常黑胆质成熟剂水提物和醇提物中总黄酮含量测定及重现性实验精密称取异常黑胆质成熟剂水提物和醇提物的干燥粉末各5份，每份约0.50 g，制备25 ml样品溶液共10份,每份按“2.1.5 标准曲线的制备”项下方法显色,以不含硝酸铝的样品溶液作空白, 在510 nm波长处测定供试品溶液的吸光度,按以下公式计算供试品中总黄酮的含量。
       
       样品中总黄酮含量(mg/g) =(C×10×25)/m
       
       其中C为10 ml样品溶液中总黄酮浓度(mg/ml)，m为供试品取样量(g)。
       
       实验结果表明，异常黑胆质成熟剂水提物中总黄酮含量为16.21 mg/g，相对标准偏差为2.11%，而异常黑胆质成熟剂醇提物中总黄酮含量为19.04 mg/g，相对标准偏差为3.14%，说明该测定方法重现性良好。见表6。
       2.2  总酚含量的测定
       2.2.1  Folin-Ciocalteu试剂的配制［8］称取80 g钨酸钠和20 g钼酸钠于圆底烧瓶中，用560 ml 蒸馏水溶解，加入85％的磷酸溶液40 ml和80 ml浓盐酸，文火回流10 h，然后加入12 g硫酸锂及60 ml双氧水，加热沸腾15 min至亮黄色，不得带微蓝和绿色。冷却，移入1  000 ml容量瓶中，定容，贮于棕色瓶中。
       2.2.2  对照品溶液的配制精密称取一水合没食子酸(gallic acid monohydrate，纯度99.0%) 0.101 4 g，定容至100 ml。精密量取该溶液1.2 ml，用超纯水定容至50 ml，即得对照品溶液（每毫升含无水没食子酸22 μg）。
       2.2.3  标准曲线的制备精密吸取上述对照品溶液0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5 ml于10 ml容量瓶中，加入超纯水至5.0 ml，加入0.5 ml Folin-Ciocalteu 试剂，摇匀,6 min 后再加入20％Na2CO3溶液1.5 ml，用超纯水定容至10 ml，室温下反应2 h(注意避光)，以第1个溶液为空白，在765 nm波长处测定对照品溶液的吸光度，以对照品的含量为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。结果见表7。
       表6  总黄酮含量测定结果（略）
       表7  不同浓度没食子酸的吸光度及LOD，LOQ值（略）
       实验结果表明，没食子酸浓度在1.1～7.7 mg/ml范围内线性关系良好。得回归方程：A= 0.144 1C +0.027 5，相关系数r=0.999 3。最低检测限为0.01 μg/ml，最低定量限为0.03 μg/ml。
       2.2.4  供试品溶液的配制精密称取异常黑胆质成熟剂水提物和醇提物的干燥粉末各取5份，每份约0.1 g，分别加入少量超纯水完全溶解后用超纯水定容至100 ml，即得。
       2.2.5  精密度实验精密量取同一批已知浓度的样品溶液5份，每份1.0 ml，分别按“2.2.3 标准曲线的制备”项下方法显色，以试剂溶液为空白对照，进行含量测定。结果见表8。
       表8  供试品溶液的精密度（略）
       2.2.6  加样回收率的测定精密量取同一批已知浓度的样品溶液10份，每份1.0 ml，分两组，一组各加入没食子酸标准品溶液0.5 ml，另一组各加入1.0 ml, 分别按“2.2.3 标准曲线的制备”项下方法显色后，以试剂溶液为空白，进行含量测定，重复3次，并计算回收率。
       表9  供试品溶液的加样回收率（略）
       结果表明，该方法加样回收率为99.5%～104.8%。
       2.2.7  异常黑胆质成熟剂水提物和醇提物中总酚含量测定及重复性实验异常黑胆质成熟剂水提物和醇提物各取5份，每份约0.1 g，供试品溶液每份各吸取1.0 ml，分别置于5个10 ml量瓶中, 按“2.2.3 标准曲线的制备”项下方法显色，同样以试剂溶液为空白，在765 nm波长处测定供试品溶液的吸光度，按以下公式计算供试品中总酚类化合物含量。
       
       样品中总酚含量(mg/g) =(C×10×100/1000)/m
       
       其中C为10 ml样品溶液中总酚浓度(mg/ml)，m为供试品取样量(g)。
       
       代入回归方程后所得结果见表10。
       表10  总酚含量测定结果（略）
       实验结果表明，异常黑胆质成熟剂水提物中总酚含量为38.28 mg/g，相对标准偏差为2.07%，而异常黑胆质成熟剂醇提物中总酚含量为21.54 mg/g，相对标准偏差为4.46%，说明该测定方法重复性良好。
       3  讨论
       
       在测定异常黑胆质成熟剂水提物总黄酮含量时发现，在波长510 nm处, 显色和未显色供试品溶液的吸光度之差ΔA值无最大值，而已显色和未加入硝酸铝的供试品溶液的吸光度之差ΔA值最大，提示供试液中某些化学成分可能与碱作用生成有色物质而引起误差，故本法以未加入硝酸铝溶液的样品溶液作空白，测定样品溶液的吸光度，以含有显色试剂的溶剂为空白，测定对照品。该两种方法准确性强，精密度高，重现性好，适宜用作异常黑胆质成熟剂中总黄酮和总酚含量的测定。
       
       研究结果表明，异常黑胆质成熟剂醇提物中的总黄酮含量高于水提物，表明70%乙醇有利于异常黑胆质成熟剂黄酮类化合物的提取。而异常黑胆质成熟剂醇提物中的总酚含量明显低于水提物，提示水有利于极性较大的非黄酮类多酚化合物的提取。
       【参考文献】
         　［1］ 阿不都热依木·玉苏甫.维医异常黑胆质成熟剂对HepG2细胞生长和凋亡及相关基因调控的研究［D］.乌鲁木齐：新疆医科大学，2005：121.
       
       ［2］ 阿不都热依木·玉苏甫，哈木拉提·吾甫尔，希尔艾力·吐尔逊，等.异常黑胆质成熟剂黄酮类化合物诱导HepG2细胞凋亡机制的研究［J］.中国中药杂志，2007，32(11)：1068.
       
       ［3］ Yusup A, Upur H, Tursun X, et al. The effect of Abnormal Savda Munziq total flavonoids on the proliferation, apoptosis and correlative gene expression in human hepatoma (HepG2) cells［J］.Toxicology Letters, 2006, 164(Supplement 1):250.
       
       ［4］ Wang Y, Ohtani K, Kasai R, et al. Flavonol glycosides and phenolics from leaves of Cordia dichotoma［J］.Nature Medicine, 1996, 50(5):367.
       
       ［5］ Yoshida T, Amakura Y, Liu YZ, Okuda T. Tannins and related polyphenols of euphorbiaceous plants. XI. Three new hydrolyzable tannins and a polyphenol glucoside from Euphorbia humifusa［J］.Chem Pharm Bull (Tokyo), 1994, 42(9):1803.
       
       ［6］ Nomura T, Fukai T, Akiyama T. Chemistry of phenolic compounds of licorice (Glycyrrhiza species) and their estrogenic and cytotoxic activities［J］.Pure Appl Chem, 2002, 74(7): 1199.
       
       ［7］ Alali FQ, Tawaha K, El-Elimat T, et al. Antioxidant activity and total phenolic content of aqueous and methanolic extracts of Jordanian plants: an ICBG project［J］.Nat Prod Res, 2007, 21(12):1121.
       
       ［8］ 田文礼，孙丽萍，董 捷，等. Folin-Ciocalteu比色法测定蜂花粉中的总酚［J］.食品科学，2007，28(2):258.