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       【摘要】 
       ：目的研究祛疣洗剂制备工艺，优选最佳提取、纯化工艺条件。方法以羟基红花黄色素A含量、含固量为检测指标，用正交实验考察了3种因素（加水量、煎煮时间、煎煮次数）对其水煎煮工艺的影响；然后比较了不同的醇沉浓度的去杂效果。结果祛疣洗剂最佳水提工艺条件为加12倍量水，煎煮2次，1 h/次；去杂工艺以60%醇沉为佳。结论制备工艺合理。
       【关键词】  祛疣洗剂 高效液相色谱 正交实验 醇沉 羟基红花
       
       黄色素A祛疣洗剂是江苏省中医药研究院临床经验方，疗效确切。该方由狼毒、红花、板蓝根等6味药组成，具有清热解毒，杀虫除湿之功，用于治疗各种赘疣。红花为本方中主要药味，主要活性成分为羟基红花黄色素A。为了确保该制剂制备工艺的合理性，我们以羟基红花黄色素A为主要考察指标，对处方的水煎煮工艺和纯化工艺进行了优选，确定了合理的制备工艺。
       1  仪器与试药
        1.1  仪器  Waters高效液相色谱仪（Alliance2695四元泵及自动进样系统，996二极管阵列检测器，Empower色谱工作站）；Millipore Milli-Q纯水器；METTLER万分之一及百万分之一电子天平。
        1.2  试药  羟基红花黄色素A对照品（批号:11637-200502），由中国药品生物制品检定所提供，供含量测定用；水为重蒸水；甲醇、乙腈为色谱纯；其他试剂均为分析纯。
       2  方法与结果
        2.1  水煎煮工艺条件优选
        2.1.1  正交实验设计［1］ 根据预实验，对影响水提取工艺的主要因素（加水量、提取时间、提取次数）按4因素3水平进行L9（34 ）正交实验。各因素水平安排见表1。 表1  正交实验因素水平
        2.1.2  样品制备  按处方比例称取药材145 g，分别按正交实验表各行所列条件煎煮，滤过，合并滤液，减压浓缩（<65℃）至2 000 ml。
        2.1.3  含量测定 
        含固量测定：精密量取样品液25 ml，水浴蒸干，105℃烘3 h，取出置干燥器内冷却30 min，迅速称重。结果见表2。
        羟基红花黄色素A的含量测定：①色谱条件［2，3］：色谱柱为Alltima C18（4.6 mm×250 mm ，5 μm）；流动相为甲醇-乙腈-0.5%磷酸水（26∶2∶72）；流速1.0 ml·min-1；检测波长400 nm；柱温35℃。在此条件下羟基红花黄色素A与相邻峰达到基线分离（见图1）。②对照品溶液的制备：精密称取羟基红花黄色素A对照品1.866 mg置于10 ml量瓶中，用25%甲醇溶解并定容至刻度，即得每毫升含0.186 6 mg的对照品溶液。③供试品溶液的制备：取正交实验样品液适量，离心，上清液过0.45 μm的微孔滤膜，即得供试品溶液。④标准曲线的制备：精密吸取羟基红花黄色素A对照品溶液1，5，10，15，20，25 μl，注入液相色谱仪，测定其峰面积，以进样量（μg）为横坐标，峰面积为纵坐标，得回归方程：Y=2.55×106X-2.20×105，r=0.999 8。⑤精密度实验：精密吸取对照品溶液10 μl，连续进样6次，峰面积的RSD为0.4%。⑥供试品溶液的含量测定：精密吸取供试品溶液10 μl，注入液相色谱仪，依法测定，计算含量。结果见表2。
        2.1.4  方差分析结果  将1～9号实验综合评分进行方差分析，结果见表3。表3  方差分析结果
        2.1.5  正交实验优选结果  由直观分析可知，极差(R)最大的为C因素,其次分别为B因素、A因素。说明对羟基红花黄色素A及浸出物含量影响最大的为煎煮次数，其次分别为煎煮时间、加水量，最佳组合为A3B2C2；从方差分析结果可知：A，B，C 3因素均无统计学意义（P>0.05），选任何水平都可以，所以以极差分析结果A3B2C2作为最佳提取工艺，即加12倍量水，煎煮2次，煎煮1 h/次。
        2.1.6  验证实验  按优选的最佳提取工艺进行实验，测定样品中羟基红花黄色素A的含量及浸出物含量。结果见表4。表4  工艺验证实验结果 由表4可见，确定的提取工艺优于正交实验中的任何一组，且重复性较好，说明确定的工艺合理。
        2.2  纯化工艺中醇沉浓度的优选
        2.2.1  样品液的制备  按处方比例称取药材725 g，依照最优提取工艺进行煎煮，减压浓缩（<65℃）至相对密度为1.10（60℃）的清膏，备用。
        取清膏3份，每份100 ml，分别加乙醇111，171，280 ml，使乙醇浓度达50%，60%，70%，室温下静置48 h，抽滤，将滤液用相应浓度乙醇定容至400 ml，备用。
        2.2.2  含量测定 
        含固量测定：精密量取醇沉前药液10 ml及醇沉液50 ml，水浴蒸干，105℃烘3 h，取出置干燥器内冷却30 min，迅速称重，计算即得。
        羟基红花黄色素A含量测定：精密量取醇沉前药液2 ml置100    ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜，得清膏供试品溶液；精密量取3种不同醇沉液2.5 ml,置10 ml量瓶中，加相应浓度的乙醇稀释至刻度，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜，得醇沉供试品溶液。精密吸取各供试品溶液20 μl，注入高效液相色谱仪，依法测定。结果见表5。表5  醇沉优选结果羟基红花黄色素A含量指每毫升清膏醇沉后所含有的羟基红花黄色素A的量；去杂率（%）指除去杂质的量占清膏含固量的百分比
        2.2.3  醇沉优选结果  由表5可以看出，50%乙醇沉淀时指标成分损失最大，去杂率较好，但沉淀呈泥沙状，滤过困难，可行性较差；60%乙醇沉淀时，指标成分损失较小，去杂效果较好，且沉淀呈絮状，静置后呈块状，易滤；70%乙醇沉淀时，指标成分损失和去杂效果均与60%醇沉接近。从节约成本和醇沉效果方面考虑最终确定去杂工艺为60%乙醇沉淀。
       3  讨论
        文献报道［4，5］，红花及以红花为主的复方多采用水为提取溶媒，但羟基红花黄色素A的热稳定性较差，不宜长时间加热提取、浓缩。经实验比较，50℃温浸与热回流对红花中羟基红花黄色素A的提取效果相当，但长时间浓缩会影响羟基红花黄色素A的含量，采用减压浓缩，温度控制在65℃以下，收到了较好的效果。
        本实验采用HPLC法测定羟基红花黄色素A含量的方法，经方法学考察，具有准确、可靠、简便的特点，可作为祛疣洗剂的含量控制方法。
        
       【参考文献】
         ［1］ 祝德秋，程华丰.正交试验法优选排石合剂的提取［J］.中成药，2003，25(5)：421.
       
       ［2］ 国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社,2005：103.
       
       ［3］ 陆仙芸，林德军，徐升亮．HPLC测定注射用红花中红花黄色素A［J］.中草药，2006，37(5)：704.
       
       ［4］ 夏新华，吴 卫，何 莉．均匀设计方优选红花提取工艺［J］.中药材，2006，29（11）：1251.
       
       ［5］ 金雪峰，黄罗生，平其能，等.红花与川芎混合提取工艺的研究［J］.海峡药学，2007，19（2）：47.