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       【摘要】 
       目的对不同时期的大蒜多糖组分C进行提取纯化并测定其含量。方法用无水丙酮提取的方法分离纯化大蒜多糖组分C，以苯酚-硫酸显色后用紫外分光光度计测定吸光度，测定波长486 nm。结果在4.0～10.0 μg/ml范围内，浓度与吸光度呈良好线性关系，回归方程 A=0.069 4C-0.004 9 (R=0.999 6，n＝7)。不同时期的大蒜中多糖组分C的含量：2月份的含量87.82%，4月份的含量88.52%，6月份的含量93.61%，7月份的含量94.28%，11月份的含量85.17%。结论6～7月份大蒜多糖组分C的糖含量最高。
       【关键词】  大蒜多糖组分C 苯酚-硫酸法
       大蒜为百合科葱属植物生蒜Allium sativum L．的鳞茎，其性味生辛热、熟辛温，具有温中消食、化肉消谷、解毒除邪、攻冷积和杀虫的功效，作为中药使用已有几千年的历史。我国是世界上最大的大蒜生产国。目前，从天然产物中寻找新的药效成分已成为国际上研究的新动向，多糖的研究颇受关注。多糖是由十个以上单糖通过苷键连接而成的聚糖。它在自然界分布极广，在高等植物、藻类、菌类及动物体内均有存在，是自然界含量最丰富的生物聚合物。大蒜多糖是从大蒜球根中提取的活性成分，本科室通过大量的实验研究发现大蒜多糖具有保肝护肝作用［1，2］、抗病毒［3，4］、保护心肌［5］等作用。大蒜采收期为每年的6～7月份，为了更合理地开发利用，我们对不同时期大蒜中的多糖组分C进行糖含量比较分析，旨在为大蒜多糖C的药效学研究提供基础资料。
       1    器材
        1.1  药材市售山东产大蒜。
        1.2  试剂葡萄糖标准品，上海化学试剂公司；苯酚，上海化学试剂公司；硫酸(分析纯)，上海化学试剂有限公司；95％ 乙醇；蒸馏水 。
        1.3   仪器UV-754型紫外可见分光光度计(澳大利亚VARIAN公司)；TD－II台式低速自动平衡离心机(湖南星科科学仪器有限公司)；FA1104电子分析天平(上海精密科学仪器有限公司)。
       2    方法与结果
        2.1    大蒜多糖组分C的分离纯化  新鲜大蒜去皮 → 碾成蒜泥 → 无水乙醇浸泡过夜 → 尼龙布过滤 → 沉淀用无水乙醇浸泡1 h → 尼龙布过滤 → 沉淀用无水乙醇浸泡24 h → 尼龙布过滤 → 沉淀（即脱脂蒜泥）用双蒸水溶解 → 沸水浴8 h → 冷却 → 尼龙布过滤 → 滤液中滴加4～5倍无水乙醇 → 静置72 h → 抽滤 → 滤液68 ℃水浴约8 h蒸出乙醇 → 滤液中滴加3 ～ 4倍丙酮 → 静置6 h → 抽滤 →得大蒜多糖组分C粗品。粗品Sevage法去蛋白后在55℃下干燥至恒重得大蒜多糖组分C精制品。纯化后得大蒜多糖组分C在紫外可见光谱段进行扫描，结果显示在190 nm处有多糖的特征吸收峰，而在260 nm和280 nm 处无吸收，表明大蒜多糖组分C中无蛋白质成分。见图1。
        2.2    溶液的配制
        2.2.1   5%苯酚溶液的配制取苯酚100 g，加铝片0.2 g和NaHCO3 0.1 g，蒸馏。收集180～182 ℃ 馏分，精密称取精制苯酚5.0 g溶解后转至100 ml容量瓶中定容，摇匀，得5%苯酚试剂。
        2.2.2   标准品溶液的制备精密称取105 ℃干燥至恒重的葡萄糖10.0 mg置100 ml容量瓶中，加水溶解，稀释至刻度，摇匀即得浓度为100 μg/ml的标准品溶液。
        2.2.3    供试品溶液的制备  精密称取55 ℃下干燥至恒重的大蒜多糖组分C 5.0 mg，置100 ml容量瓶中，加双蒸水溶解，稀释至刻度，摇匀即得多糖供试品溶液50 μg/ml。
        2.3    检测波长的选择  精确量取的葡萄糖溶液、样品溶液1.0 ml分置于两支干燥试管中，分别加入5%苯酚溶液1.0 ml摇匀，然后加入浓H2SO4 5.0 ml摇匀，另以1.0 ml水同上操作，作为空白液，于室温中放置5 min，沸水浴中恒温15 min，取出，冰水浴冷却至室温，在波长400～800 nm之间扫描。结果供试品与标准品溶液在486 nm波长处均有最大吸收，而空白溶液在此波长无干扰，故选用486 nm 为检测波长。 见图2～3。
        2.4    标准曲线的测定 精密量取标准品溶液0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0 ml，分别置7只试管中，各加蒸馏水至1.0 ml，再加5％苯酚溶液1.0 ml，摇匀后再加入浓H2SO4 5.0 ml，摇匀，室温下放置5 min，沸水浴中恒温15 min，取出，冰水浴冷却至室温，在486 nm处，以蒸馏水管作为空白对照，测定各浓度标准液的吸光度，以糖浓度C为横坐标，吸光度A为纵坐标绘制标准曲线，计算得回归方程A=0.069 4C-0.004 9 (r=0.9996，n=7），在4.0～10.0 μg/ml范围内，浓度与吸光度呈良好线形关系。
        2.5   换算因子f的测定  精密称取55 ℃下干燥至恒重的不同时期提取的大蒜多糖组分C 10.0 mg，置100 ml量瓶中，加适量双蒸水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为多糖储备液(100 μg/ml )。精密吸取多糖储备液2.0 ml, 按绘制标准曲线的方法测定吸光度，由回归方程计算出多糖液中葡萄糖的质量浓度(C),按下式计算其换算因数：
        f=W／C×D
        W为多糖质量(mg)；C为多糖溶液中葡萄糖的浓度(μg/ml) ；D为多糖的稀释因素。见表1。表1  不同时期大蒜多糖组分C的换算因子
        2.6    精密度实验 随机取标准曲线绘制中其中一支葡萄糖试管液，反复测量该标准液的吸光度5次，结果RSD=0.18％。见表2。表2  精密度实验
        2.7  重复性实验  精密称取同一批次供试品大蒜多糖组分C共5份各约5.0 mg，分别置于5个100 ml容量瓶中用双蒸水溶解定容，精密量取50 μg/ml各1.0 ml于5支干燥具塞试管中，按测定标准曲线同样的方法操作，在486.0 nm处分别测定其吸光度，计算得不同时期大蒜多糖组分C的RSD。见表3。表3  重复性实验
        2.8  稳定性实验  随机抽取重复性实验的一支试管，按测定标准曲线同样的方法测每隔20 min的吸光度，根据测定的样品溶液在100 min内其吸光度的变化情况，算得吸光度的RSD，结果表明样品溶液在100 min内显色稳定。见表4。表4  稳定性实验
        2.9    样品测定  精密称取同一批次供试品大蒜多糖组分C共5份各约5.0 mg，分别置于5个100 ml容量瓶中用双蒸水溶解定容，精密吸取50 μg/ml多糖样品溶液1.0 ml于10 ml具塞试管中，按标准曲线的绘制项下的方法操作，测定供试品溶液中葡萄糖的质量浓度，按下式计算样品中的多糖。
        多糖含量(%)=(C×D×f)/W×100％
        C为测得供试液中葡萄糖的浓度(μg/ml)；D为供试品溶液的稀释倍数；f为换算因素；W为大蒜多糖质量(μg)。见表5。表5  不同时期大蒜多糖组分C糖含量
        2.10  回收率实验  精密吸取已知含量的供试品溶液5份，各1.0 ml，分别置10 ml具塞试管中，另配制与供试品溶液浓度相近的葡萄糖对照品溶液，精密移取1.0 ml至上述具塞试管中。按测定标准曲线同样的方法操作，算得样品的平均加样回收率。见表6。表6  不同时期大蒜多糖组分C回收率
       3  讨论
        结果显示，大蒜的采收期为每年的6～7月份，而6～7月份的大蒜中大蒜多糖C的糖含量最高；故大蒜多糖组分C药效学实验时宜选用6～7月的大蒜作为研究对象，有事半功倍之效。
        不同时期大蒜多糖组分C回收率均在95%～105%之间，重复性在各月份均良好，表明苯酚-硫酸法在大蒜多糖C含量测定中显色稳定，灵敏度高，适合于大蒜多糖组分C在大蒜中的含量测定。
        
       【参考文献】
         ［1］ 郑 敏，卢葵花，吴基良，等．大蒜多糖体外抗乙型肝炎病毒作用研究［J］．中药药理与临床，2005，21(3)∶29.
       
       ［2］ 郑 敏 ，潘世斌 ，姜友定，等．大蒜多糖对肝损伤小鼠血清和肝组织ALT、AST的影响及其急性毒性实验［J］．咸宁学院学报，2003，17(2)：85.
       
       ［3］ 郑 敏，梅贤臣，鲍翠玉，等．大蒜多糖体外抗柯萨奇病毒 B3作用［J］．中国现代应用药学杂志，2005，22(1)∶4.
       
       ［4］ 蔡 飞 ，陈金和 ，吴基良．大蒜多糖对小鼠病毒性心肌炎的治疗作用［J］．武汉大学学报(医学版)，2003，24(2)∶109.
       
       ［5］ 余 薇，吴基良，汪 晖．大蒜多糖对阿霉素所致小鼠心脏毒性的拮抗作用［J］．中国药理学通报，2005，21(1)∶96.