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       【摘要】 
       目的利用单因素及响应面分析法优化蛹虫草菌丝体多糖超声提取工艺。方法通过单因素实验选取实验因素与水平，在单因素实验的基础上，以液料比、超声功率、提取时间为响应因子，进行3因素3水平的响应面实验，并与传统水提法进行比较分析。结果超声提取蛹虫草菌丝体中多糖的最佳工艺条件为：提取时间504 s，提取功率466 W，液料比104∶1（ml∶g），提取率预测值为7.47%，验证值为7.45%，与预测值的相对误差为0.27%。结论 经响应面法优化蛹虫草菌丝体多糖超声波提取工艺后，多糖得率比传统水提法有所提高，且提取时间大大减少。
       【关键词】  响应面 超声波提取 蛹虫草
       
       菌丝体多糖蛹虫草Cordycepsmilitaris(L.exFr.)Link又名北冬虫夏草、北虫草，是蛹虫草寄生在昆虫纲鳞翅目夜蛾科昆虫蛹体上所长出的子座与僵死蛹体的复合体。野生蛹虫草分布于我国东北、华北、西南地区的多个省、市、自治区［1］。蛹虫草能明显降低大鼠体内的过氧化脂质和自由基水平，延缓器官和整个机体的衰老［2］。蛹虫草菌丝体多糖因具有抗肿瘤、调节免疫、调节内分泌与营养代谢等多种生物活性而备受生物学家的关注，有广阔的开发价值和应用空间。影响真菌菌丝体多糖提取率的因素很多，如提取功率、提取时间及液料比等，必须经过大量实验进行探索提取的最佳工艺，而大多数提取工艺的优化采用的为正交实验方案等［3，4］，响应曲面法(RSM)优化多糖提取工艺的研究报道较少［5］。
        响应面分析法（Response Surface Methodology，RSM）,将数学与统计学相结合，采用多元二次回归方法作为函数估计的工具来拟合因素与响应值之间的函数关系［6］，依此可对函数的响应面和等高线进行分析来寻求最佳工艺参数。
        本工艺在蛹虫草菌丝体多糖的提取过程中，以液体深层发酵获得蛹虫草菌丝体为原料，将单因素和响应面分析法应用于超声波提取蛹虫草菌丝体多糖，研究了超声提取的条件及其对提取结果的影响，并与传统水浸提法进行了比较，为其工艺路线的改造，降低生产成本以及工业化生产提供一定的理论参考。
       1  材料与仪器
        蛹虫草菌种（CGMCC 5.0699），购于中国科学院微生物研究所； 蒽酮，浓硫酸，3,5-二硝基水杨酸，葡萄糖，所有试剂均为分析纯；
        HZQ-F160型全温振荡培养箱（哈尔滨市东联电子技术开发有限公司）， MLS-3750型高压自动灭菌锅（日本SANYO），超净工作台（苏净集团安泰公司），5810R型高速冷冻离心机（德国Eppendorf），JY92-Ⅱ超声波细胞粉碎仪（厦门精密仪器有限公司），UV-3150紫外分光光度计（日本岛津），BP221S电子天平（德国赛多利斯）。
       2  方法
        2.1  多糖的测定
        2.1.1  总糖的测定蒽酮－硫酸法［7］。
        2.1.2  还原糖的测定DNS法［8］。
        2.1.3  菌丝体多糖提取率的计算
        多糖含量=总糖含量-还原糖含量
        多糖提取率(%)=［多糖含量(g)/菌丝体质量(g)］×l00％
        2.2  菌丝体多糖的超声提取方法液体深层发酵获得蛹虫草菌丝体，冷冻干燥至恒重，粉碎，过60目筛。分别称取0.1 g菌丝体干粉，按一定液料比加入一定量去离子水，水浴中超声波提取一定时间。提取液经12 000 r/ min，4 ℃，离心10 min，上清测定总糖和还原糖的含量。
        2.3  菌丝体多糖提取单因子实验在提取过程中，利用单因子实验对影响多糖提取率的液料比、超声功率、提取时间3个主要因素进行考察。
        2.4  菌丝体多糖提取中心组合实验在单因子实验的基础上根据Box-Benhnken的中心组合实验设计原理，采用响应面法在3因素3水平上对菌丝体多糖的提取条件进行优化。按最佳提取条件进行验证实验并考察提取次数对提取率的影响。
       3  结果
        3.1  超声波提过程中的单因素影响
        3.1.1  提取时间对菌丝体多糖提取率的影响在液料比40∶1，提取功率300 W水浴中分别超声提取60，120，180，240，300，360，420，480，540，600 s，然后测定菌丝体多糖提取率，结果见图1。
        从结果可以看出，提取时间480 s时多糖得率最大。提取时间低于480 s时多糖得率随着提取时间的增加而增加，大于480 s时多糖得率反而有所降低。
        3.1.2  超声功率对菌丝体多糖提取率的影响菌丝体干粉按液料比40:1加入蒸馏水，分别于功率200，240，280，320，360，400，440，480，520 W下水浴中超声波提取180 s。不同超声功率下菌丝体多糖得率结果见图2。
        从图2中可以看出，超声功率为440 W时菌丝体多糖得率最大。其后随着超声功率的增大多糖得率明显下降。
        3.1.3  液料比对菌丝体多糖提取率的影响提取过程中用水量是限制多糖得率的重要因素。菌丝体干粉分别按液料比20∶1，30∶1，40∶1，50∶1，60∶1，70∶1，80∶1，90∶1，100∶1，110∶1加入蒸馏水，超声功率440 W，水浴中提取480 s。菌丝体多糖得率结果如图3所示。
        图3  液料比对多糖提取率的影响
        从结果可以看出，液料比低于100:1时，多糖得率随着液料比的增加而增加，液料比为100:1时多糖得率已经达到极值。因此选择最佳液料比为100:1。
        3.2  响应面分析法对蛹虫草菌丝体多糖提取工艺的优化根据单因素探索的实验结果，以液料比、超声功率、提取时间3个因素为自变量，菌丝体多糖提取率为响应值，采用响应面分析法在3因素3水平上对菌丝体多糖提取过程进行优化，以达到最大限度提取的目的。实验因素与水平设计见表1。响应面实验方案及结果见表2。表1  响应面分析因素与水平对提取时间X1、超声功率X2和液料比X3各水平进行如下编码：X1=（Z1-480）/60，X2=（Z2-440）/80，X3=（Z3-100）/10，以X1，X2，X3为自变量，以多糖提取率Y为响应值，分析方案及实验结果见表2。
        表2中实验1～12为析因试验，13～15为中心实验。15个试验点分为析因点和零点,其中析因点为自变量取值在X1，X2，X3所构成的三维顶点；零点为区域的中心点，零点实验重复3次，用以估计实验误差。采用SAS RSREG 程序对所得数据进行回归分析。结果见表3。表2  响应面分析方案及实验结果表3  回归分析结果对表中数据进行回归分析，获得蛹虫草菌丝体多糖提取率对编码自变量提取时间、超声功率、液料比的二次多项回归方程：
        Y=7.324 98+0.239 11X1+0.286 67X2+ 0.217 07X3-0.248  52X12-0.187 20X1X2+ 0.066 37X1X3-0.361 01X22+0.079 82X2X3- 0.315 06X32回归方程中各变量对响应值影响的显著性由F检验来判定，P值越小，则相应变量的显著程度越高。由表3可以看出，方程中X1，X2，X3，X12，X22，X1X2对响应值的影响最为显著。在各影响因素中，提取功率对多糖提取率的影响最大。实验因子对响应值不是简单的线性关系，二次项和交互项与响应值都有很大的关系，说明方程的拟合是充分的，回归方程也是高度显著的，相关系数R2为96.23 %。同时失拟项也进一步表明回归方程可以较好地描述各因素与响应值之间的真实关系，因此可以利用该回归方程确定最佳提取工艺条件。
        根据回归分析结果做出相应的响应曲面图及其等高线图，以确认提取时间、超声功率、液料比3因素对多糖提取率的影响，结果如图4～6。
        从响应面的最高点和等高线可以看出在所选的范围内存在极值，响应面的最高点同时也是等值线中的最小椭圆的中心点。图4表明X1、X2的交互作用显著，在所选范围内，X1取不同的编码值时X2对Y的影响表现出不同的规律；同样，X2取不同的编码值时X1对Y的影响规律也呈一定的变化趋势。从图5、6可以看出，X1与X3，X2与X3的交互作用并不显著，它们对Y值的影响规律并不会随着另一因素的改变而有明显变化。3个因素对Y值的影响以及各因素之间的交互影响与回归分析结果吻合。SAS工具箱给出了能够得到最大响应值(Y)的X1，X2，X3对应的编码值X1=0.411，X2=0.338，X3=0.431，即在提取时间为504 s，液料比为104∶1，提取功率为466 W时提取率有最大值7.47%。
        3.3  验证实验为了检验模型预测的准确性，按最佳提取条件提取，实验重复3次。3次平行实验的多糖提取率分别为7.48 %，7.47 %和7.39%，平均提取率为7.45 %，与理论预测值相比相对误差为0.27 %，可见该模型能较好地模拟和预测蛹虫草菌丝体多糖提取率。
        3.4  提取次数对多糖提取率的影响验证实验提取1次后残渣再按最佳条件提取第2次、第3次，测定各次提取液总糖、还原糖含量。结果提取1，2，3次的多糖提取率分别为7.46 %，1.49 %，0.51 %。以3次多糖的提取率为100 %计，第1次多糖的提取率为78.86 %，第2次为15.75 %，第3次为5.39 %。尽管增多提取次数可以增加多糖的提取率，但从经济角度看并不合算。因此，选择两次提取较合适。
        3.5  超声提取法与水浸提法比较分别采用按响应面法优化得到的最佳超声提取条件和最优水浸提条件提取蛹虫草深层发酵菌丝体中多糖(文章已单独发表),比较两种方法。结果见表4。表4  超声提取法和水浸提法比较从表4可知，超声波提取法与传统水提法相比,提取时间缩短96%，多糖得率提高5.62%。
       4  结论
        本实验通过单因素实验对影响蛹虫草菌丝体多糖提取的主要因素—提取时间、超声功率、液料比进行了探索，选取中心组合实验的范围和水平，应用响应面分析法对各因素的最佳水平范围及其交互作用进行了研究和探讨，建立了影响多糖提取率的二次多项数学模型，依据回归分析结果知，蛹虫草菌丝体多糖超声提取的最佳工艺条件为：提取时间504 s，提取功率466 W，液料比104∶1（ml∶g）。在此条件下，实际提取率7.45%，与模型理论预测值7.47%的相对误差为0.27%。该方法与传统水提法相比，提取时间缩短96%，多糖得率提高5.62%。实验结果证明，采用响应面分析法优化蛹虫草菌丝体多糖的超声波提取工艺条件准确可靠，具有实际价值。
        
       【参考文献】
         ［1］ 段 毅.蛹虫草高效培养技术［M］.郑州：河南科学技术出版社，2004：24.
       
       ［2］ 王 琦，韩晓龙.蛹虫草对老年大鼠自由基代谢影响的研究［J］.辽宁师范学报，2002，4（4）：104.
       
       ［3］ 熊中良, 邓春生. 真菌多糖免疫活性的研究进展［J］. 江西农业学报, 2006, 18 (2) : 118.
       
       ［4］ 高丽君, 王汉忠, 崔建华, 等. 白首乌可溶性多糖提取工艺研究［J］.食品科学, 2004, 25(10): 178.
       
       ［5］ 李亚娜, 林永成, 余志刚. 响应面分析法优化羊栖菜多糖的提取工艺［J］.华南理工大学学报(自然科学版), 2004, 32(11) : 28.
       
       ［6］ 叶 红,吴 涛,周春宏.马尾藻多糖提取工艺的优化［J］.食品研究与开发,2006,27（7）: 22.
       
       ［7］ 张惟杰.糖复合物生化研究技术，第2版［M］.杭州:浙江大学出版社,2003:103.
       
       ［8］ 滕利荣.生物学基础实验教程［M］.长春：吉林科学技术出版社,1999：541.