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比色法测定南蛇藤中总三萜类成分的含量
作者:季春 张融 胡晨 游文玮 佟丽    
作者单位:1.南方医科大学中医药学院,广东 广州 510515; 2.南方医科大学药学院,广东 广州 51051

《时珍国医国药》 2009年 第4期

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       【摘要】 
       目的建立南蛇藤提取物总三萜类成分的含量测定方法,为南蛇藤药材的质量控制提供依据。方法采用比色法进行测定,以齐墩果酸为对照品,样品经5%香草醛-冰醋酸、高氯酸显色,在560 nm处测定。结果在0.42~16.8 μg·ml-1范围内吸光度与含量成良好的线性关系,r=0.999 3(n=7),平均加样回收率为98.22%,RSD=3.77%(n=6)。结论该法操作简便、快速、灵敏,测定结果准确、可靠,可作为南蛇藤药材的一种定量分析方法。
       【关键词】  南蛇藤 总三萜 比色法
       南蛇藤Celastrus orbiculatus Thunb.系卫矛科(Celastraceae)南蛇藤属Celastrus藤本植物,又名过山风、黄藤、降龙草等。南蛇藤始载于清代《植物名实图考》[1],其藤茎、根、叶、果实、种子均可入药,药性辛温、有小毒,功效祛风、除湿、活血、解毒、消肿,主要用于治疗筋骨疼痛、腰腿痛、风湿性关节炎、跌打损伤、痈肿疮疡等病症[2]。前期实验结果表明,南蛇藤提取物具有较好的抗炎镇痛作用,并对大鼠佐剂性关节炎具有较强的抑制作用[3~5]。为进一步控制药材质量,本实验采用香草醛-冰醋酸、高氯酸比色法,对南蛇藤提取物中的总三萜类成分进行含量测定。
       1  仪器与材料
        1.1  仪器HP8453紫外-可见光分光光度计(惠普公司 美国),Sartorius CP225D十万分之一天平(赛多利斯有限公司 德国)。
        1.2  试剂高氯酸、冰醋酸、醋酸乙酯、甲醇、香草醛均为分析纯,由广州化学试剂公司提供;齐墩果酸对照品购于中国药品生物制品检定所(批号110709-200304);南蛇藤从广东省药材公司购买,经南方医科大学中医药学院中药鉴定教研室马骥教授鉴定为南蛇藤Celastrus orbiculatus Thunb.。
       2  方法与结果
        2.1  对照品溶液的配制精密称取齐墩果酸对照品10.5 mg,置10 ml容量瓶中用甲醇定容。再准确移取2 ml此溶液至10 ml容量瓶中并用甲醇定容,制成0.21 mg·ml-1对照品溶液。
        2.2  供试品溶液的制备称取南蛇藤原药材1 000 g,用8倍量75%乙醇回流提取2 h,过滤,滤渣再用5倍量75%乙醇回流提取1 h,过滤,合并滤液并浓缩至每克浸膏相当于原药材2~4 g。浸膏用蒸馏水洗涤,60℃恒温箱干燥24 h。精密称取该干燥粉末100 mg,用甲醇超声提取30 min,转移至100 ml容量瓶中定容。准确移取4 ml至100 ml容量瓶中用甲醇定容,即得浓度为0.04 mg·ml-1的供试品溶液。
        2.3  测定波长的选择取齐墩果酸对照品溶液,(空白对照为不加对照品溶液用醋酸乙酯稀释至刻度的混合溶液)加5%香草醛-冰醋酸0.4 ml,高氯酸1.6 ml显色[6]后,进行可见-紫外全波长扫描。结果表明,对照品溶液在560 nm处有最大吸收峰(如图1),多次重复,峰形一致且空白对照无干扰,故选择560 nm作为样品测定的波长。
        图1  齐墩果酸可见-紫外吸收峰图
        2.4  标准曲线的制备精密吸取齐墩果酸对照品溶液0.02,0.05,0.1,0.2,0.4,0.6,0.8 ml,水浴挥干,分别加5%香草醛-冰醋酸0.4 ml,高氯酸1.6 ml[6],置70℃水浴加热15 min,迅速冰浴冷却后,转移至10 ml的量瓶中加醋酸乙酯定容至刻度,摇匀。在560 nm波长处测定吸收值A,空白对照为不加对照品溶液而直接加5%香草醛-冰醋酸0.4 ml,高氯酸1.6 ml,用醋酸乙酯稀释至刻度的混合溶液。
        标准曲线:A=59. 983C-0.020 6,其中C为浓度(mg·ml-1),A为吸收度。
        相关系数:r=0.999 3,线性范围为0.42~16.8 μg·ml-1。
        2.5  稳定性实验取样品溶液,照“2.4”项下操作,每隔0.5 h测定一次,前5次测定值RSD=5.16%(n=5),结果表明,本方法在2 h内基本稳定。
        2.6  回收率实验精密称取样品4 mg于100 ml容量瓶中用甲醇定容,精密称取齐墩果酸对照品4 mg于10 ml容量瓶中用甲醇定容,准确移取2 ml供试品溶液和75 μl对照品溶液于具塞试管中,共6份,按制备标准曲线项下操作,测得吸收值并计算含量,经计算回收率为98.22%。结果见表1。
        2.7  精密度实验精密吸取对照品溶液0.4 ml,照“2.4”项下操作,结果RSD=3.96%(n=10)。
        2.8  样品的含量测定精密量取供试品溶液2 ml共6份。按标准曲线制备相同操作,水浴挥干,分别加5%香草醛-冰醋酸0.4 ml,高氯酸1.6 ml,置70℃水浴加热15 min,冰浴冷却后,转移至10 ml量瓶中加醋酸乙酯稀释至刻度,摇匀。在560 nm波长处测定吸收值,代入标准曲线方程,计算含量。结果总三萜类成分平均含量为37.93%,RSD=1.6%(n=5)。结果见表2。表1  加样回收率测定结果表2  含量测定结果
        2.9  药材含量测定精密称取南蛇藤药材粉末(过40目筛)40 mg,置50 ml量瓶中,加入甲醇20 ml,超声提取90 min,滤过,用适量甲醇洗涤药渣定容至50 ml,摇匀。吸取0.1 ml,置10 ml量瓶中,照“2.8”项下操作,代入标准曲线方程,计算含量。结果总三萜类成分平均含量为12.87%,RSD=3.39%(n=5)。
       3  讨论
        目前总三萜类成分的含量测定多采用重量法和比色法[7],考虑到重量法适合对原料药材进行定量鉴别,实验操作复杂,受各种试剂的用量、反应温度、反应时间等诸多因素影响较为显著。本实验直接以甲醇作为溶剂,以醋酸乙酯制备各溶液,采用了香草醛-冰醋酸、高氯酸比色法进行测定,相比其他文献报道的比色法减化了实验步骤,缩短了实验时间,同样达到很好的测定效果。实验结果表明,若反应条件控制得当,测定结果稳定,重复性好,本实验方法可作为本药材质量评估的一种检测手段。
        致谢:在本课题研究过程中,感谢中药化学教研室朱全红教授给予的悉心指导,感谢课题组贺丰博士、辛增辉硕士给予的帮助!
       【参考文献】
         [1] 黄泰康.现代本草纲目[M].北京:中国医药科技出版社,2001:1859.
       
       [2] 张 舰,许运明,王维民,等. 南蛇藤提取物体内抗肿瘤作用的实验研究[J].中国中药杂志,2006,31(18):1514.
       
       [3] Li Tong,Kamal D Moudgil. Celastrus aculeatus Merr. Suppresses the induction and progression of autoimmune arthritis by modulating immune response to heat-shock protein 65[J].Arthritis research & therapy,2007,9(4):R70.
       
       [4] 杨蒙蒙,佟 丽,陈育尧.南蛇藤不同提取部位的抗炎作用实验研究[J].中药新药与临床药理,2004,15(4):241.
       
       [5] 杨蒙蒙,佟 丽,陈育尧.南蛇藤乙醇提取物抗炎作用实验研究[J].中医药学刊,2005,23(1):51.
       
       [6] 舒任庚,刘玉凤,舒积成.比色法测定青钱柳中三萜类成分的含量[J].中国现代应用药学,2006,23(5):406.
       
       [7] 周俐斐,芦柏震,侯桂兰.中药三萜类化合物的提取分离及测定方法研究进展[J].海峡药学,2007,19(3):62.

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