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       【摘要】 
       目的评价引种紫锥菊多糖、咖啡酸、烷酰胺三类成分的免疫调节作用，同时比较引种与进口紫锥菊免疫调节作用的异同。方法采用MTT法及ELISA法测定正常小鼠脾淋巴细胞增殖及免疫因子白细胞介素-2（IL-2）和干扰素-γ（IFN-γ）的分泌，以此评价引种紫锥菊三类成分的免疫调节作用，并比较进口与引种紫锥菊的作用异同。结果引种紫锥菊多糖、咖啡酸、烷酰胺三类成分均能增强Con A刺激的正常小鼠脾淋巴细胞增殖，三类成分对脾淋巴细胞产生IFN-γ也表现出一定的促进作用，但对IL-2的生成，咖啡酸类成分显示较强的抑制作用。引种紫锥菊在促淋巴细胞增殖方面与进口紫锥菊相同，但促IFN-γ生成作用强于进口紫锥菊，而促IL-2分泌作用不及进口紫锥菊。结论引种紫锥菊及其主要成分的免疫促进作用与进口紫锥菊相当，可作为进口紫锥菊替代品进行相关开发利用研究。
       【关键词】  引种紫锥菊 多糖 咖啡酸 烷酰胺 淋巴细胞增殖 白细胞介素-2 干扰素-γ
       Immunostimulatory Effect of the Main Active Fractions from Introduced Echinacea purpurea
        WU Jianming，  ZOU Wenjun
        （Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 610075, China）
        Abstract：ObjectiveTo investigate the immunomodulatory action of polysaccharides, caffeic acid derivatives and alkylamides from introduced E. purpurea，and to compare the immunomodulatory  effect of foreign and introduced E. purpurea.MethodsThe proliferation of murine spleen lymphocyte and the secretion of IL-2 and IFN-γ were measured by MTT and ELISA assay to evaluate the immunomodulatory action. ResultsThe three fractions from introduced E. purpurea promoted the proliferation of lymphocytes and the secretion of IL-2 and IFN-γ stimulated by Con A, however, caffeic acid derivatives inhibited the secretion of IL-2. The results from the comparison of foreign and introduced E. purpurea extracts revealed that introduced extract was equally as effective as the foreign extract for the proliferation of lymphocytes. For the secretion of cytokines, each had his strong point between foreign and introduced extracts. Introduced extract showed better effect than foreign extract for IFN-γ production, but not as good as foreign extract for IL-2 production. ConclusionThe introduced E. purpurea and their fractions had the similar immunomodulatory action as foreign E. purpurea, suggesting introduced E. purpurea will be important resources of medicinal materials in developing immunomodulatory agent or food supplement in China.
        Key words：Introduced Echinacea purpurea;  Polysaccharides;   Caffeic acid derivatives;   Alkylamides;   Lymphocyte proliferation;   IL-2;   IFN-γ
        紫锥菊为菊科紫锥菊属Echinacea Moench植物，作为药用品种有3种，即紫锥菊E. purpurea Moench、狭叶紫锥菊E. angustifolia DC.和白紫锥菊E. pallida Nutt.［1］，其中以紫锥菊的市场需求量为最大。紫锥菊原产于北美，但欧洲和其它地区有引种栽培，近年在我国北京、上海、南京、湖南、山东等地也相继引种成功［2］，并已形成一定的产业化规模。进口紫锥菊及其成分的研究已经十分广泛，其免疫调节作用也很确切，而且以进口紫锥菊为原料生产的免疫调节剂或保健食品也具有显著的功效，为我国引种紫锥菊的开发利用展现了良好的市场前景［3］。但引种的紫锥菊及其成分能否作为免疫调节剂原料使用，还缺乏相关的实验研究支持。尽管已有研究报道紫锥菊的理化性质或成分分析［4，5］，但对引种紫锥菊及其成分的免疫调节作用研究仍然十分有限［6］，进口和引种紫锥菊在免疫调节活性方面的差异也无人报道。本实验采用小鼠脾淋巴细胞培养并结合细胞因子检测方法，研究了引种紫锥菊中三类成分对Con A刺激的正常小鼠淋巴细胞增殖的影响，同时比较了进口与引种紫锥菊乙醇提取物对Con A刺激的淋巴细胞作用的差异，为我国利用引种紫锥菊开发免疫调节剂或保健食品提供实验依据。
       1  材料与仪器
        1.1  药材和试剂　进口紫锥菊，购自美国“Mountain Rose Herb”植物药公司，经鉴定为紫锥菊Echinacea purpurea Moench。引种紫锥菊（品种引自美国），购自四川凉山种植基地，经鉴定为紫锥菊Echinacea purpurea Moench。RPMI 1640培养基，GIBCO公司产品；小牛血清（FBS），上海轻工产品；青霉素、链霉素，华北制药厂产品；四甲基偶氮唑盐（MTT），Sigma公司产品；刀豆蛋白A(Con A),Sigma公司产品；异丙醇、甲醇、乙醇、醋酸乙酯、氯仿均为分析纯，广东光华化学厂产品；小鼠白细胞介素-2（IL-2）以及小鼠干扰素-γ（IFN-γ） ELISA检测试剂盒均由晶美公司提供。
        1.2  动物清洁级昆明种小鼠，雌雄兼用，体重18～22 g。由河南郑州大学实验动物中心提供，合格证号SCXK(豫）2005-0001。
        1.3  仪器倒置相差显微镜：重庆光学仪器厂产品；Benchmark酶标仪：BIO-RAD公司产品；Allegra 64R型高速冷冻离心机：Beckman公司产品；DU640紫外分光光度计：Beckman公司产品；Waters2690高效液相色谱分析仪：Waters公司产品；SANYO CO2培养箱，日本SANYO公司产品。
       2  方法
        2.1  紫锥菊提取物的制备
        2.1.1  进口、引种紫锥菊醇提物将进口、引种紫锥菊全草均粉碎为粗粉，用75% EtOH提取3次，1 h/次。合并醇提液，减压回收EtOH，于50℃烘干即得上述两种样品。
        2.1.2  引种紫锥菊多糖以引种紫锥菊为原料，采用水提醇沉方法制备［7］，用硫酸－蒽酮法定量测定，多糖含量为38.26%。
        2.1.3  引种紫锥菊咖啡酸类成分将引种紫锥菊粉碎成粗粉，用10倍量MeOH回流提取3次，1 h/次，合并提取液，回收MeOH，以热水溶解，EtOAc萃取3次，合并萃取液，浓缩EtOAc，以2% Na2CO3溶液萃取3次，合并Na2CO3溶液，用HCl酸化，再以EtOAc萃取，回收EtOAc即得咖啡酸类成分［8］。以菊苣酸为指标成分，TLC进行定性鉴别，以HPLC进行含量测定，提取物中菊苣酸的含量为58.71%。
        2.1.4  引种紫锥菊烷酰胺类成分以引种紫锥菊为原料，用10倍量95% EtOH超声提取3次，1 h/次,合并提取液，回收EtOH，以热水溶解，CH3Cl萃取3次，回收CH3Cl置50 ℃浓缩干燥即得［9］。经紫外分光光度法测定其烷酰胺类成分为28.37%。
        2.2  体外脾淋巴细胞培养　参照文献［10］ ，取清洁级KM小鼠10只，♀♂兼用，断颈处死小鼠，立即分离脾脏，将脾脏剪碎，用1640培养液混悬并轻轻吹散细胞，静置除去组织块，取上清离心收集细胞，再用0.83% NH4Cl溶液破除红细胞，用无血清1640洗涤3次，离心弃上清，加入含10%小牛血清、5 μg/ml Con A的1640培养基，调整细胞密度为3×105个细胞/孔，以180 μl体积接种于96孔板；分别加入上述5种紫锥菊提取物20 μl，起始浓度为100 μg/ml， 10倍连续稀释至0.01 μg/ml，同时设置药物空白对照，置37℃，5％ CO2恒温培养箱中培养72h，每种提取物浓度及对照均为3复孔操作，培养的细胞部分用于MTT检测淋巴细胞增殖，上清部分用于IL-2及IFN-γ ELISA试剂盒定量测定。
       3  结果
        3.1  引种紫锥菊三类成分对Con A刺激淋巴细胞增殖的影响用MTT法检测了引种紫锥菊中三类成分对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响，结果如图1所示，多糖、咖啡酸、烷酰胺三类成分均能增强Con A刺激的正常小鼠脾淋巴细胞增殖，咖啡酸的作用尤其明显，在0.1 μg/ml浓度时其增殖率高于对照组达36.30%；此外，样品浓度对淋巴细胞增殖率也有一定影响，低浓度作用促淋巴细胞增殖能力增强，而高浓度作用时淋巴细胞增殖能力减弱。
        提取物浓度C/μg·ml-1
        图1  引种紫锥菊中三类成分对Con A刺激淋巴细胞增殖的影响
        3.2  引种紫锥菊三类成分对Con A刺激淋巴细胞分泌IL-2、IFN-γ的影响结果见图2～4。图2显示，多糖、烷酰胺类具有明显促Con A刺激淋巴细胞分泌IL-2的作用，以低浓度最为明显，在0.01 μg/ml浓度下，多糖、烷酰胺类分别高于对照组80.87%和59.10%，随样品浓度的加大，多糖、烷酰胺促IL-2生成作用有所下降，但仍明显高于对照组水平，而咖啡酸类成分则显示较强的抑制作用。图3显示，多糖、烷酰胺、咖啡酸三类成分均有不同程度促Con A刺激淋巴细胞分泌IFN-γ作用，其作用特点为加大药物浓度，促IFN-γ分泌也增高，多糖类成分较为明显。
        图2  引种紫锥菊三类成分对Con A刺激淋巴细胞分泌IL-2的影响
        图3  引种紫锥菊三类成分对Con A刺激淋巴细胞分泌IFN-γ的影响
        3.3  进口、引种紫锥菊提取物对Con A刺激淋巴细胞增殖的影响图4显示，进口紫锥菊与引种紫锥菊乙醇提取物均能促进Con A刺激的正常小鼠脾淋巴细胞增殖，二者作用强度与作用趋势均相似；因此，进口紫锥菊与引种紫锥菊对正常小鼠脾淋巴细胞增殖影响无显著差异。
        图4  进口、引种紫锥菊提取物对Con A刺激淋巴细胞增殖的影响
        3.4  进口、引种紫锥菊提取物对Con A刺激淋巴细胞分泌IL-2、IFN-γ的影响结果见图5～6。图5显示，进口紫锥菊与引种紫锥菊乙醇提取物均能促进Con A刺激淋巴细胞分泌IL-2，前者明显优于后者，在低浓度时作用更为明显，但在高浓度（100 μg/ml）时，进口紫锥菊与引种紫锥菊乙醇提取物促Con A刺激淋巴细胞分泌IL-2作用相当。图6显示，进口紫锥菊与引种紫锥菊乙醇提取物均具有促进Con A刺激淋巴细胞分泌IFN-γ作用，但就其作用强度看，引种紫锥菊作用明显高于进口紫锥菊。尤以低浓度最为明显，在0.01 μg/ml浓度下，引种紫锥菊促IFN-γ分泌水平高于进口紫锥菊达54.95%。
        图5  进口、引种紫锥菊提取物对Con A刺激淋巴细胞分泌IL-2的影响
        图6  进口、引种紫锥菊提取物对Con A刺激淋巴细胞分泌IFN-γ的影响
       4  讨论
        已有研究报道引种紫锥菊对小鼠巨噬细胞的非特异性免疫作用［6］，但对引种紫锥菊的特异性免疫调节作用有待确认。此外，国外研究已报道，紫锥菊多糖、咖啡酸衍生物、烷酰胺类成分均有一定的免疫调节活性［11～14］，但引种紫锥菊中这三类成分的免疫调节活性还有待证实。本文采用正常小鼠脾淋巴细胞培养技术，结合MTT法和ELISA法研究了引种紫锥菊中多糖、咖啡酸、烷酰胺类成分对Con A刺激淋巴细胞增殖及其分泌IL-2和IFN-γ的作用，结果表明，紫锥菊中三类成分均能增强Con A刺激的小鼠脾淋巴细胞增殖，其中，咖啡酸衍生物的作用最为明显，此结果与国外研究结果相吻合［1，15］，以上结果也提示引种紫锥菊的免疫调节作用应体现多成分的组合，而非单一成分所能替代。紫锥菊的三类成分对IFN-γ的分泌也表现为促进作用，对IL-2的分泌，多糖和烷酰胺类表现为促进，咖啡酸则显示较强的抑制作用。
        至今，尚无人对进口、引种紫锥菊的免疫调节作用进行比较，通过用正常小鼠脾淋巴细胞的研究表明，进口与引种紫锥菊均能促进Con A刺激的小鼠脾淋巴细胞增殖，其中进口优于引种紫锥菊。在促淋巴细胞分泌IL-2和IFN-γ作用上，二者各有侧重，进口紫锥菊促IL-2的分泌作用明显强于引种紫锥菊，但促IFN-γ分泌作用则弱于引种紫锥菊。总之，进口与引种紫锥菊对正常小鼠T淋巴细胞的调节作用较为相似，在促IL-2和IFN-γ分泌作用则各有侧重。
        通过小鼠脾淋巴细胞的研究提示，引种紫锥菊对T淋巴细胞具有一定的免疫调节作用。但引种紫锥菊对Con A刺激的淋巴细胞增殖并不能完全反映其全面的免疫调节作用，对B淋巴细胞的作用以及对免疫功能低下小鼠的免疫调节作用等均有待阐明。而且，国内市场以紫锥菊为原料生产的保健食品均采用进口原料，随着紫锥菊在国内各地引种栽培面积的逐渐扩大，更应加快对引种紫锥菊品种的理化性质，成分分析、免疫调节活性以及相关药理及应用等研究，以便国内医药保健品行业尽早采用引种紫锥菊为原料生产免疫调节剂和保健食品。
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