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       【摘要】 
       目的讨论蛹虫草及其提取物对大鼠慢性肾衰竭的作用。方法采用饲喂腺嘌呤诱导大鼠慢性肾衰(CRF)模型，观察比较了空白组、阴性对照组、阳性对照组和蛹虫草子实体组CRF模型大鼠血尿素氮、肌酐、24 h尿量、尿蛋白量，以及肾组织病理变化。结果蛹虫草子实体，尤其是其多糖组分能显著降低CRF大鼠血尿素氮、肌酐，明显减轻肾脏的病理损害。结论蛹虫草子实体及其多糖组分对延缓大鼠CRF有显著作用。
       【关键词】  慢性肾功能衰竭 蛹虫草 多糖
       Effect of Cordyceps minlitaris on Adenine-induced Rat Chronic Renal Failure
       HOU Ali, LIU Yan, MENG Qingfan, FENG Yun, ZHU Kai, TENG Lirong
       （College of Life Science, Jilin University, Changchun, 130012, China）
       Abstract：ObjectiveTo discuss the effect of Cordyceps minlitaris and its extract on rat CRF. MethodsThe rat chronic renal failure (CRF) model induced by feeding adenine was used to investigate rat blood urea nitrogen, creatinine, amount of emiction within 24 h, urinary protein and pathological reaction of nephridial tissue by means of comparing the blank control, negative control, positive control with the Cordyceps minlitaris stroma of CRF rats. ResultsThe experimental results demonstrated that the Cordyceps minlitaris stroma could not only obviously reduce blood urea nitrogen and creatinine but also alleviate the pathological lesion, especially its polysaccharide. ConclusionThe Cordyceps minlitaris stroma and its polysaccharide have prominent effects on the process of rat CRF.
       Key words：Chronic renal failure (CRF);   Cordyceps minlitaris;  Polysaccharide
        
       慢性肾功能衰竭是多种原发和继发性肾脏病变持续进展的共同结果，为常见肾脏疾病，严重危害人类健康和生命。目前尚缺少积极有效的治疗方法［1］。冬虫夏草治疗该病疗效显著, 但药源少, 亟需有效替代药品。蛹虫草Cordyceps minlitaris与天然冬虫夏草同属异种，亲缘关系较近, 特别是其子实体形态, 主要化学成分以及很多药理作用相同［2］。蛹虫草对于生长环境的要求较低,液体发酵可形成菌丝体,人工大规模固体培养可获得子座。研究表明,人工培养蛹虫草有效成分的含量接近或高于冬虫夏草,故人工培养蛹虫草可以成为冬虫夏草的替代品。多糖是蛹虫草的有效成分之一,但人工培养蛹虫草中多糖对慢性肾衰作用研究尚无报道。本文采用腺嘌呤大鼠慢性肾衰模型研究了蛹虫草子实体及其粗多糖对慢性肾衰的作用, 并初步探讨了其机理。
       1材料
       1.1  药物  蛹虫草子实体（辽宁虫草园生物工程有限公司）；尿毒清颗粒剂（广州康臣药业有限公司生产, 批号: 20010416）。
       1.2  试剂  腺嘌呤［分子量135.13，含量＞98%为进口分装（中国上海）, 批号20010520］；生化测定试剂盒［尿素氮（BUN）批号20010312］、肌酐（CRE）批号20010302、血清总蛋白（TP）批号20010420、血清白蛋白（ALB）批号20010219，均为上海科华-东菱诊断用品有限公司产品；US-11多项尿液分析试纸条（苏州医药集团有限公司）；其它试剂均为本室配制。
       1.3  动物  Wistar雄性大鼠, 购于长春高新医学动物实验研究中心, 合格证号SCXK-（吉）2003-004。
       2  方法
       2.1  腺嘌呤致大鼠慢性肾衰模型的建立  取Wistar雄性大鼠70只，体重（200±10） g，除10只留做空白对照（A）组外, 其余大鼠均按每日250 mg/kg体重给予0.75%的腺嘌呤饲料, 每日定时投放, 自由摄取, 正常饮水, 经过4周, 行眼底静脉丛采血, 进行血清肌酐（Scr）、血尿素氮（BUN）检查, 模型组Scr （88.53±6.98） μmo1/L, BUN （29.39±5.43） mmo1/L, A组Scr （40.33±4.17） μmo1/L, BUN （8.99±3.71） mmo1/L。检验结果证明造模成功，按Scr高低随机分成6组,阴性对照（B）组10只, 阳性对照（C）组10只, 虫草混悬液高剂量（D）组10只, 虫草混悬液低剂量（E）组10只, 虫草水提液（F）组10只, 虫草多糖（G）组10只。分组及给药情况见表1。
       2.2  蛹虫草混悬液的配制   冷藏干燥蛹虫草子实体干燥, 粉碎, 研磨 过80目筛，收集粉末, 用蒸馏水配制1 g/5 ml浓度的混悬液。
       2.3  蛹虫草水提液的制备  冷藏干燥蛹虫草子实体干燥, 粉碎, 精确称量20 g，加入300 ml蒸馏水中, 微沸状态，回流提取3 h, 6 000 r/min离心20 min，取上清液,浓缩至100 ml，所得浅棕褐色液体即蛹虫草子实体水提液。
       2.4  蛹虫草多糖溶液的制备  取冷藏干燥的蛹虫草子实体, 精确称量20 g, 粉碎后分别以甲醇和醋酸乙酯各回流3 h脱除有色物质及脂溶性成分, 离心收集沉淀, 挥发干燥。加入300 ml蒸馏水中, 微沸状态, 回流提取3 h，6 000 r/min离心20 min, 取上清液, 浓缩至100 ml, 加入四倍体积无水乙醇，使之终浓度为80%, 静置沉淀过夜。6 000 r/min离心20 min, 收集沉淀, 待乙醇充分挥发之后, 溶于50 ml蒸馏水中, Sevag法除蛋白，蒸馏水透析过夜, 浓缩至20 ml, 所得深棕褐色液体即蛹虫草子实体多糖溶液［3］。
       2.5  尿毒清混悬液配制  尿毒清颗粒剂给药前用蒸馏水配成0.5 g/ml的混悬液。
       2.6   慢性肾衰大鼠的治疗  治疗方法采用灌胃给药, 灌胃量及每日生药量如表1, 治疗4周后结束。
       2.7  指标检测  大鼠治疗4周, 末次灌胃后, 禁食不禁水收集24 h尿液, 测尿蛋白量, 眼底静脉丛取血, 利用生化分析仪测定血清中尿素氮（BUN）, 肌酐（Scr）等肾功能指标［4］。
       表1  大鼠分组给药情况（略）
       2.8  肾脏病理改变及病理积分的计算［5］大鼠处死后解剖观察（见图1），取肾称重，用10%甲醛溶液固定, 常规石蜡包埋, 切片, 做HE染色, 进行病理组织学观察。参照Purkerson等对肾小球病变组织学的分级标准, 分为5个等级：0级，Ⅰ级，Ⅱ级，Ⅲ级，Ⅳ级。每张切片连续观察50个肾小球, 并分别归入上述5个等级, 计算各个等级肾小球所占的比例。病理积分为各级病变肾小球所占的百分比乘以相应级数之和。
       3  结果
       3.1  一般情况空白对照组大鼠生长旺盛, 十分活跃，毛色光洁, 饮水量稳定, 摄食量及体重呈递增状态; 阴性对照组大鼠体重增长明显缓慢, 外观可见体毛蓬松, 无光泽，活动少, 畏寒拱背, 应激能力弱, 实验期间阴性对照组死亡率很高（见表2）, 相比之下蛹虫草（两个剂量组、水提液组和多糖组）及尿毒清阳性对照组动物的外观状态明显好于阴性对照组。
       图1  肾小球病变分级（略）
       3.1.1  体重给药前后实验鼠体重变化见图2。由图2可知，各组体重增幅分别为39.6%，53.3%，65.8%，63.9%，66.35%，66.8%和82.39%。
       图2  给药前后CRF模型大鼠体重变化对比图（略）
       3.1.2  存活率和死亡率蛹虫草子实体对大鼠腺嘌呤肾衰模型存活率及死亡率影响见表2。由表2可见, 在给药4周后给药各组大鼠的体重增长幅度明显高于阴性对照组, 而动物的死亡率则明显低于阴性对照组。其中多糖组体重增加量与阴性对照组体重增加量有极显著差异（P＜0.01）,且死亡率为0; 其他给药组与阴性对照组存在显著差异（P＜0.05）。由此表明: 蛹虫草子实体, 尤其是其多糖组分，对腺嘌呤所致CRF模型大鼠的肾脏损伤具有保护作用。
       表2  蛹虫草子实体对大鼠腺嘌呤肾衰模型存活率及死亡率影响（略）
       3.2  生理生化指标的改变
       3.2.1  蛹虫草子实体对大鼠腺嘌呤肾衰模型24 h尿蛋白总量的影响尿蛋白总量测定结果见图3。由图3可见阴性对照组、阳性对照组及虫草低剂量组尿蛋白无显著差异（P＞0.05）, 而高剂量组、水提液组与阴性对照存在显著差异（P＜0.05）, 多糖组最接近正常对照组水平, 与阴性对照组存在极显著差异（P＜0.01）。由此提示蛹虫草口服给药对肾小管的损伤具有一定的恢复作用。
       图3  大鼠给药4周后24 h尿蛋白量（略）
       3.2.2  肾功能测定从表3的结果可见, B组、E组与A组比较, 血清中BUN和Scr含量, 以及Ccr均有显著差异（P＜0.01）, 而C组、D组及F组与A存在明显差异（P＜0.05）, 蛹虫草多糖组3项指标与正常对照组比较没有差异性（P＞0.05）。由此提示蛹虫草生药, 水提液, 尤其是蛹虫草多糖, 口服给药对肾脏代谢有一定的调节作用。
       表3  蛹虫草子实体对大鼠腺嘌呤肾衰模型肾功能的影响（略）
       3.3  大鼠肾脏解剖观察结果  空白对照组大鼠肾脏呈褐色, 外形正常, 表面光泽, 切面观察皮髓质界限清晰。阴性对照组大鼠肾脏为“大白肾”, 因肾体积及重量明显增大。且肾脏表面凸凹不平, 有灰黄色颗粒状腺嘌呤代谢物, 肾包膜与肾实质黏连不易剥离, 颜色呈灰白色, 切面观察肾皮质变薄，皮、髓质界限不清, 切面有白色颗粒散在分布。蛹虫草给药组及尿毒清颗粒剂治疗组大鼠肾脏也明显增大, 色泽呈灰褐色, 切面观察有白色颗粒散在分布, 但其外观病变程度较轻 肾脏表面的灰黄色颗粒状代谢物分布较阴性对照组少, 且肾脏的颜色比较深表面壁光滑。
       3.4  病理组织学检查结果  正常对照组大鼠肾组织结构正常; 而其它各组大鼠的肾脏组织均有程度不同的病理损伤，特别是阴性对照组的正常肾小球数目明显减少, 出现严重的玻璃样病变（见图4）。肾小管破坏明显, 扩张呈囊状, 出现颗粒样变性 伴随坏死脱落, 并且肾间质内有明显的腺嘌呤代谢产物结晶的沉积, 并有大量的淋巴细胞浸润, 部分肾小管管腔内可见蛋白管型（见图5）。而各给药组均可见上述病变, 但尿毒清组、蛹虫草高剂量组、水提物组及蛹虫草多糖组病理有明显改善, 且蛹虫草多糖组明显优于其它4组。肾组织病变程度轻, 肾小管破坏程度小, 肾小管上皮细胞颗粒样变性明显减少, 结晶沉积少, 水肿轻, 部分肾小管形态接近正常, 由此可见，蛹虫草对腺嘌呤所致的肾脏损伤具有保护和促进肾组织的修复作用。从表4的结果可见，蛹虫草低剂量组与阴性对照组比较, 肾小球半定量病理积分无差异性（P＞0.05）；蛹虫草高剂量组及尿毒清颗粒剂治疗组与阴性对照组存在差异（P＜0.05）；水提液组、蛹虫草多糖组有明显差异（P<0.01）。由此推测蛹虫草, 特别是蛹虫草多糖存在抗慢性肾衰作用。
       图4  给药28 d后10倍光镜下各组肾皮质比较图（略）
       图5  给药28 d后40倍光镜下各组肾小管比较图（略）
       表4  各组慢性肾衰大鼠的病理改变情况（略）
       每5个10×16倍视野内可见肾小球病变个数, “+”： 1～3个；“++”：4～6个；“+++”：7～10个；“++++”10个以上。肾小管病变, “+”：上皮细胞刷状缘退化; “++”：上皮细胞肿胀;“+++”：上皮细胞脱落; “++++”：上皮细胞坏死。间质内炎细胞浸润, "+": 少量炎细胞浸润; “++”：介于其间; “+++”：大量炎细胞浸润。管型, “+”：少量透明管型; “++”：介于其间; “+++”：多量透明管型，还可见颗粒管型。每5个10×20倍视野内可见病灶数, “+”：1-2个; “++”：3-4个; “+++”：5～6个以上小病灶或成片弥漫分布
       4  讨论
          
       肾脏疾病是常见病, 不论何种病因, 也不论是免疫机制或非免疫机制, 如果得不到有效治疗, 达到一定程度的肾实质损害后, 都有CRF进行性和不可逆转的特点。因此, 世界上有多于透析病人数倍的早期患者迫切需要一些能够延缓乃至停止肾衰进展的治疗方法。
       
       实验表明蛹虫草Cordyceps militaris不仅有助于延缓早期患者CRF病程进展, 而且可以改善晚期患者的生存质量, 减少血液透析带来的副作用。
       
       饲喂大鼠腺嘌呤的方法能够较好地建立慢性肾衰模型［6］，异常高浓度腺嘌呤通过黄嘌呤氧化酶的作用生成极难溶于水的2,8-二羟基腺嘌呤，后者沉积在肾小管，影响了氮质化合物的排泄，导致氮质血症，毒素蓄积及电解质、氨基酸代谢紊乱，最终引起肾功能衰竭，另外，体内氧自由基产生过多和脂质过氧化亦可能是引起CRF的机理［7］。本次研究发现, 蛹虫草子实体及其提取物能明显降低血清肌酐、尿素氮水平, 改善肾功能, 延缓CRF的进程，与尿毒清相比具有显著差异。蛹虫草子实体对肾功能的稳定作用可能是通过促进肾小管上皮细胞的修复, 恢复肾小管功能, 组织肾脏间质纤维化、肾小球硬化, 及促进机体蛋白质合成, 纠正负氮平衡等途径而达到延缓CRF进程的目的。
       
       从肾脏病理学角度来看, 蛹虫草子实体及其提取物能有效延缓肾小球硬化进度，减轻肾组织的病理损害程度，这可能是蛹虫草子实体延缓慢性肾衰进程的基础。综上所述，蛹虫草是一种潜在的极具开发价值的能减缓慢性肾衰进程的中草药。
       【参考文献】
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