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       【摘要】 
       目的探讨蒿鳖养阴软坚方治疗CCl4等所致肝纤维化的作用。方法0.5 ml CCl4/100 g wt皮下注射16次(后15次注射用CCl4∶橄榄油=4∶6, V/V)辅以10%乙醇为饮料制备肝纤维化模型，成模后以蒿鳖养阴软坚方治疗，灌胃用药［24.48 g/kg(生药/体重)和8.16 g/kg，每周6 d］2个月。结果8.16 g/kg蒿鳖养阴软坚方能明显降低肝纤维化大鼠肝组织胶原蛋白含量及血清透明质酸和IV型胶原(P<0.05)。结论蒿鳖养阴软坚方具有治疗CCl4等所致肝纤维化的作用。
       【关键词】  四氯化碳所致肝纤维化 蒿鳖养阴软坚方 治疗作用 胶原纤维 羟脯氨酸 透明质酸 IV型胶原
       The Effect of Hao-bie Yangyin Ruanjian Prescription in Treating Hepatic Fibrosis Caused by CCl4
       KONG Weihan, HAO Jie, FANG Buwu, ZHANG Yongjin, XING Wei, LIU Jieying, LING Ningsheng, ZHANG Yuping, CUI Zhiqing
       1.Tianjin Medical University, Tianjin 300070, China; 2.Zhongxin Pharmaceutical Factory, Tianjin 300457, China; 3.Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300193, China
       Abstract：ObjectiveTo estimate the effect of Hao-bie Yangyin Ruanjian Prescription in treating hepatic fibrosis caused by CCl4. MethodsHepatic fibrosis models prepared by subcutaneously injecting 0.5ml CCl4/100g BW into rats for 16 times (in each of the last 15 times, CCl4 with olive oil (V/V=4/6) was injected) and feeding them with 10% ethanol. After the models established, the rats were treated with Hao-bie Yangyin Ruanjian Prescription per os ［24.48 g/kg (crude drug/BW) and 8.16 g/kg, six days per week］ for 2 months. ResultsThe Hao-bie Yangyin Ruanjian Prescription at the dosage of 8.16g/kg could significantly reduce the content of collagen in liver, serum hyaluronic acid and type-IV collagen level in rats with hepatic fibrosis (P<0.05).ConclusionHao-bie Yangyin Ruanjian Prescription can treat hepatic fibrosis induced by CCl4.
       Key words：Carbon tetrachloride;  Hepatic fibrosis;  Hao-bie Yangyin Ruanjian Prescription;  Therapeutic effect;  Collagenous fiber;  Hydroxyproline;  Hyaluronic acid;  Type-IV collagen
       肝纤维化存在于各种慢性肝病的发病过程中，发病率高。慢性肝病活动期(如慢性活动型肝炎、活动期肝硬化、慢性重症肝炎)通常出现阴虚血淤证型，且病情较重、治疗较难。临床流行病学调查［1］结果显示，阴虚血淤是肝炎后肝硬化最常见的证型之一，有阴虚兼证的占47.04%(135/287)。而目前上市的抗肝纤维化药物几乎均以益气活血法为主组方，不宜用于阴虚血瘀证型。蒿鳖养阴软坚方为方步武融会《温病条辨》青蒿鳖甲汤方义、朱起贵教授治疗慢性肝病的用药经验和现代药理研究的成果等创制的一首方剂。该方以养阴活血软坚、凉血清热解毒法组方，由青蒿、鳖甲、知母、生地、丹参、虎杖、白花蛇舌草等9味药组成，用于治疗阴虚血淤、血热毒蕴的肝纤维化。本研究采用CCl4等制备肝纤维化模型，成模后以该方的粗提物治疗，以明确蒿鳖养阴软坚方治疗肝纤维化的作用，为其临床应用与进一步研发提供实验依据。1  材料与仪器
       1.1 动物
       SPF级Wistar大鼠46只，雌雄各半，体重220～240 g，由军事医学科学院实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK-（军）2002-001。饲养于天津医科大学实验动物中心，自由进食水。
       1.2 药品
       先将鳖甲煎煮2 h，加入其他八味药材，6倍量水提取1次，1 h/次；将药渣晾干，用60％乙醇6倍量提取2次，0.5 h/次。合并滤液，回收乙醇，浓缩样品液，定容至所需浓度(含生药2 g/ml)。在中新药业天津乐仁堂制药厂和天津隆顺荣制药厂提取。
       1.3 试剂
       L-羟脯氨酸，电泳纯，上海康达氨基酸厂生产，批号920506；对二甲氨基苯甲醛，分析纯，天津化学试剂研究所生产，批号20020322；高氯酸，优级纯，天津市化学试剂一厂生产，批号20070039；橄榄油，化学纯，北京化学试剂公司生产，批号：69018028；四氯化碳，分析纯，天津大学科威公司生产，批号 20061028；甲醛溶液，分析纯，天津市化学试剂六厂生产，批号 20060912；透明质酸(HA)和IV型胶原(IV-C)放射免疫分析试剂盒由天津九鼎医学生物工程有限公司提供；III型胶原(III-C)放射免疫分析试剂盒为上海海研医学生物技术有限公司产品，批号 20080401；其他均为市售分析纯试剂。
       1.4 仪器
       VIS-7220紫外可见分光光度计，北京瑞利分析仪器公司生产；光学显微镜，日本Olympus公司生产。
       2 方法
       2.1 模型制备
       对Miyazaki方法［2］略加修改：按体重随机区组分组法，随机取8只大鼠为正常对照组(正常组，其中1只换垫料时跑掉)，其余大鼠用于造模。造模第1次四肢皮下注射CCl4 0.5ml/100g体重，以后每隔3天四肢皮下注射CCl4橄榄油溶液（CCl4∶橄榄油=4∶6, V/V）0.5 ml/100 g体重，共注射16次，平时以10%乙醇为唯一饮料，但注射前一天临时改为洁净自来水为饮料，注射后再立即改为10%乙醇。造模时不用玉米面、猪油、胆固醇，而用大鼠标准饲料。正常组大鼠不行造模处理。
       2.2 分组与给药
       造模45天后，随机取8只造模鼠(短模组)，经肝组织羟脯氨酸(hydroxyproline, Hyp)含量测定与肝组织形态学观察证实肝纤维化形成。对其余造模鼠按体重随机区组分组法分为3组：模型对照组(长模组)、蒿鳖养阴软坚方大剂量组、蒿鳖养阴软坚方小剂量组(临床等效剂量组)。造模成功后开始治疗用药：蒿鳖养阴软坚方大、小剂量组分别每天灌胃24.48g/kg和8.16g/kg，体积均为13ml/kg，1次/d，每周用药6 d，连续2个月。正常对照组和长模组灌胃等体积蒸馏水。最后1次灌胃结束24 h后，大鼠以水合氯醛麻醉，仰卧位剖腹，腹腔静脉取血，分离血清，-20℃保存。取肝组织分别以10%中性甲醛固定及入氯仿∶甲醇(2∶1,V/V)的液体中脱水脱脂。
       2.3 指标检测
       2.3.1 肝组织羟脯氨酸(hydroxyproline, Hyp)含量测定
       采用Jamall法，将Hyp (μg/mg)乘以系数22.38(6000/50×7.46/40)(μg/mg=mg/g，胶原蛋白/肝干粉)。
       2.3.2 血清肝纤维化指标检测
       III型胶原(PIIIP)、IV型胶原(IV-C)、透明质酸(HA)采用放射免疫分析法，见试剂盒说明。
       2.3.3 肝组织形态学观测
       常规石蜡切片，HE染色和胶原染色，光镜观察。肝纤维化程度分期标准参照文献［3］，分为0，1，2，3，4期：无，为0期；汇管区扩大, 纤维化，为1期；汇管区周围纤维化, 纤维隔形成, 小叶结构保留，为2期；纤维隔伴小叶结构紊乱, 无肝硬化，为3期；早期肝硬化或肯定的肝硬化，为4期。
       2.4 统计分析
       计量资料表示为±s，采用SPSS8.0统计软件，两组间比较用t检验，多组间比较用单因素方差分析，其中每两组间比较在方差齐性时用LSD检验而方差不齐时用Tamhane检验。半定量资料采用Ridit分析。
       3 结果
       3.1 一般情况正常组大鼠生长良好，皮毛柔顺有光泽，活泼好动，饮食正常；模型组大鼠精神差，活动少，皮毛松弛无光泽；治疗组大鼠皮毛少光泽，但精神较好。
       3.2 治疗用药对肝组织胶原蛋白含量的影响蒿鳖养阴软坚方8.16 g/kg(生药/体重)能明显降低肝组织胶原蛋白。见表1。表1  蒿鳖养阴软坚方对CCl4致纤维化大鼠肝胶原蛋白及纤维化程度分期的影响（略）
       3.3 对大鼠血清中肝纤维化标志物的影响蒿鳖养阴软坚方8.16 g/kg能明显降低血清HA及IV-C水平。见表2。表2  蒿鳖养阴软坚方对CCl4致鼠肝纤维化血清标志物的影响（略）
       3.4 肝组织病理形态变化镜下观察：正常组大鼠肝组织可见肝板以中央静脉为中心呈条索状向四周放射样排列，板间有不规则肝窦，肝小叶内网状纤维支架结构完整，汇管区无扩大，无纤维组织增生和炎性细胞浸润；肝纤维化模型组大鼠肝小叶结构破坏，纤维组织增生明显，将肝小叶分隔成大小不等的肝细胞团，肝细胞变性坏死，并可见假小叶形成，汇管区扩大，胶原沉积；治疗组肝细胞的变性坏死程度及肝小叶结构破坏程度降低，肝胶原纤维增生亦明显减轻，纤维条索疏松变窄。模型组的肝纤维化程度分期显著高于正常组（P<0.01），各治疗组的纤维化程度均有所减降，但未见统计学差异。见表1及图1～4。
       4 讨论
       4.1  CCl4致大鼠肝纤维化模型形成通过肝组织胶原蛋白含量、血清肝纤维化标志物(HA、IV-C等)和肝组织形态学变化等定量、定性指标判定，本研究所采用的CCl4等可致大鼠肝纤维化模型形成。本文肝组织胶原蛋白含量是通过所测定的Hyp换算出来的，Hyp是组成机体胶原蛋白的一种特有的氨基酸，除外弹性蛋白含少量Hyp(约1%)，几乎所有Hyp均存在于胶原，因此其能定量反映肝纤维化的程度。同时造模组肝脏纤维组织增生显著，可见假小叶形成。与韩德五教授的模方法不同的是未使用玉米面、猪油、胆固醇，而用大鼠标准块料；仅用10%酒精为饮料，且在注射前一天下午17:00时左右改用洁净水为饮料，注射后又立即恢复用10%酒精为饮料，这些措施可降低造模大鼠的死亡率，更简便，同样可引起肝纤维化(虽其程度稍轻)。造模过程中大鼠死亡4只，其中1只为自然死亡(消瘦、纤维化程度重)，其余3只因捉拿时用力过大而死。CCl4是强力的肝毒剂，目前认为CCl4通过氧化应激(产生自由基、引发由COX介导的炎症反应、导致肝星状细胞活化)、增强细胞因子(TGFβ1、TNFα、ILs等)活性和引起体内相关酶系变化(ALT、AST、CYP450活性升高)而引起肝损伤［4］，这些均为肝纤维化发生的重要机制；持续使用少量乙醇可诱导CYP450酶，该酶在CCl4引起的肝纤维化过程中起着重要作用。
       4.2  蒿鳖养阴软坚方具有治疗CCl4所致大鼠肝纤维化的作用由于这里的造模仅用CCl4、酒精，未加用猪油、胆固醇、玉米面，慢性肝损伤略轻；同时采用治疗给药，一则因实验周期较长，CCl4所致肝纤维化有自行吸收倾向(事实上这是以CCl4为主要损伤因素诱导肝纤维化模型的共同不足)，二则治疗肝纤维化较之预防的难度大，但尽管如此，蒿鳖养阴软坚方仍具有良好的治疗CCl4所致大鼠肝纤维化的作用，表现为能明显降低肝组织胶原蛋白含量及血清HA和IV-C水平等公认的肝纤维化指标。也观察到蒿鳖养阴软坚方大剂量组(24.48 g/kg)的疗效不及小剂量组(8.16 g/kg)，这里的小剂量即临床等效剂量，一方面提示对慢性肝病的药物治疗要注意采用合适的剂量，另一方面说明该研究的结果对临床用药有重要的指导意义、剂量设计是合理的，为进一步研发奠定了良好的基础。
       
       总之，本研究所设计的CCl4为主并用少量乙醇的造模方案引起了明确的肝纤维化病变，蒿鳖养阴软坚方粗提物在成模后用药具有治疗CCl4等所致肝纤维化的作用，其作用机理有待进一步探讨。
       【参考文献】
         　　［1］张琴，张文彤，魏建军，等. 公因子和聚类分析联合在肝炎后肝硬化证候分类研究中的应用［J］. 中西医结合学报，2005,3(1):14.
       
       ［2］Miyazaki T, Karube M, Matsuzaki Y, et al. Taurine inhibits oxidative damage and prevents fibrosis in carbon tetrachloride-induced hepatic fibrosis［J］. J Hepatol, 2005,43(1):117.
       
       ［3］王泰龄，刘霞，高琳，等. 对慢性肝炎分类、分级分期的探讨［J］.中华肝脏病杂志，1995,3(3):130.
       
       ［4］汪涛，姜华，陆国才，等. 四氯化碳肝脏毒性机制的研究进展［J］.毒理学杂志，2007,21(4):833, 933.