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       【摘要】 
       目的研究牡蛎多糖对流感病毒在MDCK细胞中增殖的抑制作用。方法采用血凝滴度测定牡蛎多糖对MDCK细胞培养甲型流感病毒增殖的抑制作用；通过联合用药试验研究牡蛎多糖对利巴韦林抗流感病毒的协同效应。结果牡蛎多糖能显著降低MDCK细胞培养流感病毒的血凝滴度；牡蛎多糖与利巴韦林联合使用时，能显著抑制MDCK细胞培养流感病毒的增殖并具有相加效应。结论牡蛎多糖能明显抑制MDCK细胞培养流感病毒的增殖，对利巴韦林抗流感病毒具有相加效应，具有开发成抗流感病毒生物制剂的前景。
       【关键词】  牡蛎 多糖 流感病毒
       The Inhibitory Effects of OPS on Influenza Virus Reproduction
       LI Jiangbin, HOU Gan, LAI Yinxuan
       1.Institute of Laboratory Medicine, Institute of Biochemistry and Molecular Biology, Guangdong Medical College, Dongguan, 523808, China；2.Guangdong Medical College Affiliated Hospital, Zhanjiang, 524023，China
       Abstract：ObjectiveTo study the inhibitory effects of Oyster polysaccharides (OPS) on influenza virus reproduction in Madin-Darby canine kidney (MDCK) cell cultures. MethodsThe MDCK cell culture was used to observe the inhibition of OPS on type A influenza virus by hemagglutination test in terms of hemagglutination titer. The synergistic effect of OPS and ribavirin were studied by associating medication test.ResultsOPS could decrease the hemagglutination titer of influenza virus in MDCK cell culture. OPS and ribavirin drug combination could inhibit the proliferation of influenza virus in MDCK cell culture and had the addition effect.ConclusionOPS can significantly inhibit the proliferation of influenza virus in MDCK cell cultures. OPS has the addition effect of ribavirin on activity of anti-influenza virus. OPS has the potential to be developed as the anti-influenza virus biological agent.
       Key words：Oyster;  Polysaccharides;  Influenza virus
       
       《神农本草经》载牡蛎具有敛阴、潜阳、化痰、软坚等功用。主治惊厥、眩晕、盗汗、崩漏、带下。中华人民共和国卫生部批准其为第一批既是药材又是食品的保健品。根据分析,其肉含有大量的糖原和多糖。研究表明，牡蛎提取物有增强免疫、抗疲劳、抗肿瘤、保护肝脏和心血管、抗菌等作用［1］，本实验对牡蛎多糖抑制流感病毒在狗肾细胞（MDCK）中增殖的作用进行了研究，为进一步研究牡蛎的药用价值，深入开发海洋药用资源提供参考。
       1 材料
       牡蛎多糖 (Oyster polysaccharides,OPS)由广东医学院生物化学与分子生物学研究所提供，为多糖含量72.35%的灰白色粉状制品；甲型流感病毒干粉（A1/京防 95-267）购自国家流感中心；狗肾传代细胞（MDCK）由湛江市疾病预防控制中心提供；健康9日龄受精鸡胚由湛江海洋大学鸡场提供；利巴韦林注射液由天津药业集团新郑股份有限公司生产；MEM培养基购自Gibco公司；小牛血清购自杭州四季青生物工程公司；胰酶、EDTA 、MTT 均购自Amresco公司；DMSO 购自Sigma公司。细胞培养液：含有谷氨酰胺的MEM培养基，加入1×105U/ L青霉素，100 mg/L链霉素，10%小牛血清，使用前用NaHCO3调pH至7.5；细胞维持液：基本同培养液，但不含小牛血清，而含终浓度为2.5 mg/L胰酶，使用前用NaHCO3调pH至7.5。
       2 方法
       2.1 流感病毒扩增
       取9日龄鸡胚10个，5个注射病毒液，5个注射等体积生理盐水作为空白对照。将一瓶甲型流感病毒干粉溶于2 ml灭菌生理盐水得病毒液，用注射器注射0.2 ml病毒液入尿囊腔，然后用石蜡溶化封口，置34℃温箱培养。每日照检鸡胚一次，并180°转动鸡胚两次，弃去于24 h内死亡者。培养72 h后收获病毒液，并测定血凝滴度，若滴度较低则以收获的病毒液继续扩增至滴度256以上。依据实验需要，-25℃下短期保存或将病毒液冻成干粉后4℃长期保存。
       2.2 MDCK细胞培养
       按参考文献［2］方法，MDCK细胞在MEM基质中，37℃，5%CO2温箱内培养传代。
       2.3 甲型流感病毒在MDCK上的传代
       按参考文献［3］方法，加以改动。MDCK细胞1×108/L，按0.1 ml/孔加入96孔培养板中，置于37℃、5%CO2温箱内培养，细胞长成单层后，倾去孔中培养液。流感病毒用细胞维持液做系列10倍稀释（1～10-4），按0.1 ml/孔分别加入细胞已长成单层的96孔培养板中，每个剂量组设4个平行组，同时设正常细胞对照。置于37℃，5%CO2温箱内孵育2h，倾去上清液，更换正常细胞维持液，继续培养，倒置显微镜下观察记录细胞病变（CPE）程度。CPE特征为细胞肿胀圆化，细胞间隙增大，严重时细胞脱落。细胞出现+++病变时（细胞病变约占整个单层细胞的75%），测MTT，SPSS12.0 概率单位法（Probit）计算半数感染量（TCID50）。
       2.4 OPS对MDCK细胞的毒性测定
       MDCK细胞1×108/ L，按0.1 ml/孔加于96孔培养板中，置于37℃，5%CO2温箱内培养，细胞长成单层后，倾去孔中培养液。用细胞维持液将OPS稀释成6个剂量（800，600，400，200，100，50 mg/L），利巴韦林稀释成6个剂量（100，75，50，30，20，10 mg/L），按0.1 ml/孔分别加入细胞已长成单层的96孔培养板中，置于37℃，5%CO2温箱内培养，每个剂量组设4个平行组，同时设立正常细胞对照。72 h后测MTT。SPSS12.0 Probit计算药物和利巴韦林的半数中毒浓度(TC50)和最大无毒浓度（TC0）。
       2.5 OPS抑制细胞培养
       流感病毒增殖的试验实验分组：OPS设高（50 mg/L）、中（10 mg/L）、低（2 mg/L）3个剂量组，同时设细胞对照组、病毒对照组和利巴韦林组。MDCK细胞1×108/L，按0.1 ml/孔加入96孔培养板中，置于37℃，5%CO2温箱内培养，细胞长成单层后，倾去培养液，用PBS液洗2次。正常细胞对照组加入细胞维持液，其余各组加入含50TCID50流感病毒的细胞维持液于MDCK细胞孔中，0.1 ml/孔，37℃吸附2 h后倾去上清，用PBS液洗两次。之后正常细胞对照组和病毒对照组加入细胞维持液，其余各组加入含不同剂量OPS和利巴韦林的细胞维持液于上述已感染细胞孔内，0.1 ml/孔。每个剂量组设4个平行组。继续培养3 d后测定血凝滴度，并计算抑制倍数。
       2.6 抑制细胞培养
       流感病毒增殖的协同效应实验分组：OPS设10 mg/L和2 mg/L 两个剂量，每个剂量设单独用药和联合用药（与2 mg/L利巴韦林联用）两组，同时设正常细胞对照、病毒对照和利巴韦林组（2 mg/L）。操作同细胞培养流感病毒增殖的抑制试验。
        协同效应判断：为判断两药合用是拮抗、相加或增强的协同效应，按照金氏公式求q值［4］。q=E(A+B)/［EA + (1-EA) × EB］，E(A+B)为两药合用时的抑制率；EA、EB为各药单独使用时的抑制率。q<0.85表示两药合用有拮抗效应；q>1.15表示两药合用有增强效应；1.15>q>0.85表示两药合用有相加效应。
       2.7 统计学处理
       单因素方差分析和显著性检验由SPSS12.0统计软件分析，方差齐时，各组间两两比较采用Bonferroni检验；方差不齐时，各组间两两比较采用Tamhane’s T2检验进行。
       
       3 结果
       3.1  流感病毒扩增甲型流感病毒经鸡胚传代，滴度达256以上，无菌检测后于-70℃冻存备用。
       3.2 甲型流感病毒对MDCK的毒性经SPSS12.0 Probit 计算得流感病毒对MDCK的半数感染量（TCID50）为10-2.062。
       3.3 实验药物对MDCK细胞的毒性经SPSS12.0统计得OPS的最大无毒浓度（TC0）为100 mg/L，半数中毒浓度（TC50）612 mg/L。利巴韦林的最大无毒浓度TC0为10 mg/L，半数中毒浓度(TC50) 53 mg/L。
       3.4 OPS对MDCK细胞培养流感病毒增殖的抑制作用结果见表1，OPS剂量为2 mg/L时的抑制倍数为8；10 mg/L以上时抑制倍数为32。表明OPS能明显抑制流感病毒的增殖。表1  OPS对MDCK细胞培养流感病毒增殖的抑制作用（略）
       3.5 OPS对利巴韦林抗流感病毒的协同效应结果见表2，与利巴韦林组及同剂量OPS单独给药组相比，联合给药组的抑制倍数均明显增大。对q值分析显示，联合用药各组q值均介于0.85～1.15之间，说明OPS与利巴韦林合用时比单独使用能更好地抑制流感病毒增殖，具有相加效应。表2  OPS-利巴韦林联合用药抑制细胞培养流感病毒增殖的作用（略）
       4 讨论
          
       为研究OPS抗流感病毒活性，实验观察了OPS对MDCK细胞培养流感病毒增殖的抑制作用以及OPS对利巴韦林抗流感病毒的协同效应。实验结果表明，在MDCK细胞培养流感病毒增殖抑制实验中，2 mg/L时的抑制倍数为8；10 mg/L时以上时抑制倍数为32，明显抑制了流感病毒的增殖，表明OPS具有较强的抗流感病毒活性，且具有正相关的量效关系。
        OPS为从牡蛎中提取的多糖类物质，一般认为多糖抗病毒机制是对病毒复制早期阶段进行抑制，即抑制病毒向细胞表面的吸附。Garic等［5］认为多糖可能作为宿主受体硫酸乙酰肝素的竞争抑制剂通过与病毒糖蛋白上带正电荷的富精氨酸区域结合来阻止病毒与细胞的结合。李丽娅等［6］观察了黄芪多糖抗流感病毒的作用，黄芪多糖对流感病毒引起的小鼠肺炎病变有明显的抑制作用，能延长流感病毒感染的小鼠生存时间。肖美添等［7］鸡胚实验表明紫菜多糖具有抗甲型流感病毒活性，酸性多糖活性大于中性多糖。另外，多糖能增强免疫系统功能，提高整体免疫力，这可能也是多糖在整体情况下抗病毒的重要机理之一。
         
       OPS还显示出了对利巴韦林抗流感病毒的相加效应，提示OPS可以联合利巴韦林抑制流感病毒增殖。由于利巴韦林对人体具有一定的副作用，会对红细胞、中性粒细胞以及肝功能造成损害，少数情况下还会出现溶血性贫血并继而出现胸闷、心悸等症状，还可能出现恶心、呕吐、腹部不适等消化道症状，以及可能对心脏有损害,造成心律失常等。故联合用药不仅可以提高抗流感作用还可以降低利巴韦林的使用量，达到减毒增效的效果。提示OPS在发挥抗流感病毒作用方面可能具有独特的优势和发展前景，可以进一步作为药物或保健食品予以研究开发。
       【参考文献】
         　　［1］徐静，于红霞．牡蛎提取物的生物活性研究进展［J］．中国公共卫生，2004，20（11）：1395.
       
       ［2］张卓然．实用细胞培养技术［M］．北京：人民卫生出版社，1999：1.
       
       ［3］常曼丽，李洪源，刘电力，等．抗病毒1号中药有效部位抗流感病毒FM1的实验研究［J］．疾病控制杂志，2003，7（3）：201.
       
       ［4］兰柳波，梁念慈，莫丽儿，等．半边旗抗肿瘤有效成分5F的纯化及其体外增效作用［J］．中国药理学通报，2003，19（7）：804.
       
       ［5］Garic G，Cavallaro L，Broussalis A，et al．Biological and chemical characterization of the fraction with antiherpetic activity from Achyrocline flaccida［J］．Planta Medica，1999，65：343.
       
       ［6］李丽娅，凌秋，崔洪波，等．黄芪多糖抗流感病毒的实验研究［J］．中国中医药科技，2002，9（6）：354.
       
       ［7］肖美添，杨军玲，林海英，等．紫菜多糖的提取及抗流感病毒活性研究［J］．福州大学学报（自然科学版），2003，31（5）：631.