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       【关键词】  天年饮；,,衰老；,,睾丸；,,端粒酶
       摘要：目的观察中药天年饮对衰老大鼠睾丸生精细胞端粒酶表达的影响。方法40只SD大鼠随机分为正常组、衰老模型组、天年饮用药组和阴性对照组，每组均为10只。采用D半乳糖连续腹腔注射制作亚急性衰老的大鼠模型。ELISA方法检测各组大鼠血清睾酮含量、黄嘌呤氧化酶法检测血清超氧化物歧化酶（SOD）的活性、SP免疫组化法检测睾丸生精细胞端粒酶的表达。结果衰老大鼠血清睾酮含量、SOD活性明显下降（与正常大鼠相比P<0.05，P<0.01）；衰老大鼠睾丸生精细胞端粒酶的表达明显少于正常大鼠。天年饮可明显抑制衰老大鼠血清睾酮含量、SOD活性的下降（用药组与模型组相比P<0.05，P<0.01）；并能明显提高衰老大鼠睾丸生精细胞端粒酶的表达。结论 中药天年饮可明显改善衰老大鼠睾丸生精细胞端粒酶的表达，具有一定延缓衰老的作用。
       关键词：天年饮；  衰老；  睾丸；  端粒酶
       Effects of Traditional Chinese Medicine Tiannianyin on Telomerase Expression of Spermatogenic Cells in Testis of Aging Rats
       PANG Xiaojing， YANG Zhenjun， GUO Sen， GAO Fulu*
       （Basic Medical Institute of Chengde Medical College，Chende, Hebei 067000,China; Chengde Medical College, Chengde, Hebei 067000, China）
       Abstract：ObjectiveTo observe the effects of traditional Chinese medicine Tiannianyin on telomerase expression of spermatogenic cells in testis of aging rats. Methods40 SD rats were applied in this study and divided into 4 groups at random: normal group, aging model group, Tiannianyin group, negative control group, and each group had 10 rats. The subacutely aging model rats were made by injecting Dgal into abdominal cavity continously. ELISA was used to detect the testosterone content in serum, xanthine oxidase method to detect the superoxide dismutase (SOD) activity in serum, SP immunohistochemistry to observe the telomerase expression of spermatogenic cells in testis. ResultsThe testosterone content and SOD activity in serum of aging rats decreased significantly compared with normal rats (P<0.05, P<0.01); the telomerase positive cells of aging rats were much less than normal rats. Tiannianyin could inhibit the decreasing of testosterone content and SOD activity in serum significantly (Tiannianyin group compared with aging model group: P<0.05, P<0.01), and increase the telomerase expression significantly. ConclusionTraditional Chinese medicine Tiannianyin can improve the telomerase expression of spermatogenic cells in testis, and has fairly antiaging effects.
       Key words：Tiannianyin;  Aging;  Testis;  Telomerase
   
　　随着年龄的增长，睾丸的结构和功能会出现一个由盛到衰的演变过程，发生精子生成能力减弱、血游离睾酮含量下降等变化。天年饮(由我院中医系主任贾春华教授提供) 具有补肝肾、益精血、延年益寿之功效。本实验采用D半乳糖致亚急性衰老的大鼠模型, 观察天年饮对衰老大鼠血清睾酮含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性及睾丸生精细胞端粒酶表达的影响, 以期揭示天年饮延缓衰老的作用机理。
       　　1  材料与方法
       1.1  动物的选择及分组　实验选用4 月龄雄性SD 大鼠40 只(由河北医科大学实验动物学部提供),体重180～250 g。将40 只大鼠随机分为4组：正常组、衰老模型组、天年饮用药组和阴性对照组, 每组均为10 只。其中模型组、用药组、阴性对照组均采用D半乳糖连续腹腔注射(200 mg/kg，1次/d, 共40 d) 制作亚急性衰老的大鼠模型。模型组大鼠于造模成功后不再作任何处理；用药组大鼠于造模成功后每天用天年饮灌胃,共30 d；阴性对照组大鼠在造模成功后每天灌胃同等剂量的生理盐水,时间同用药组大鼠。
       1.2  药品及试剂天年饮由何首乌、怀牛膝、肉苁蓉、淫羊藿、丹参、茯苓6味中药组成, 经熬制后每毫升含生药1.5 g按8.1 g/kg灌胃。D半乳糖，北京化学试剂公司生产（批号：020402），用生理盐水配成5%的溶液。检测血清睾酮含量的ELISA试剂盒、端粒酶免疫组化试剂盒购自北京中山生物技术有限公司。检测血清SOD活性的试剂盒购自南京建成生物工程公司。
       1.3  指标的检测
       1.3.1  血清睾酮含量的检测大鼠经内眦取血, 离心取上清，采用ELISA方法检测大鼠血清睾酮含量。
       1.3.2  血清SOD活性的检测大鼠经内眦取血, 离心取上清，采用黄嘌呤氧化酶法检测大鼠血清SOD的活性。
       1.3.3  睾丸生精细胞端粒酶表达的观察2.5%戊巴比妥腹腔注射（0.3 ml/100 g）麻醉大鼠， 4%多聚甲醛灌注固定，取双侧睾丸入4%多聚甲醛后固定。将固定好的组织块经常规梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。Leica石蜡切片机连续切片，片厚5 μm，每隔20张取蜡带贴于涂有APES的载玻片上。SP免疫组化染色（一抗为兔抗端粒酶1∶100）显示生精细胞内端粒酶的表达，DAB显色，苏木精复染。阴性对照用PBS代替一抗。以细胞内出现棕黄色粗颗粒或细腻颗粒弥漫分布为阳性反应。
       1.4  统计处理计数资料采用t检验进行统计分析。
       　2  结果
       2.1  血清睾酮含量  结果见表1。由表中可见，与正常大鼠相比，衰老大鼠血清睾酮含量明显降低(P<0.01),天年饮可明显抑制衰老大鼠血清睾酮含量的下降, 用药组与模型组比较差异显著(P<0.01)。
       2.2  血清SOD活性见表1。由表中可见，与正常大鼠相比，衰老大鼠血清SOD活性明显下降（P<0.05），天年饮可明显抑制衰老大鼠血清SOD活性的下降，用药组与模型组比较差异显著(P<0.05)。
       表1  各组大鼠血清睾酮含量及SOD活性（略）
       与正常组比较，*P<0. 01, # P<0. 05；与模型组比较，**P<0.01，## P<0.05；n=10
       2.3  睾丸生精细胞端粒酶的表达情况  各组大鼠睾丸端粒酶免疫阳性细胞多为精子细胞，免疫阳性产物呈弥散状，主要位于细胞核，为强阳性表达，另外精子细胞的胞浆也可见端粒酶免疫阳性产物，但反应比较弱、量比较少，结果见图1。正常组大鼠端粒酶染色由图2可见生精小管近管腔侧有许多密集的精子细胞核着色；模型组大鼠见图3，着色的精子细胞数明显少于正常组大鼠；天年饮用药组大鼠见图4，阳性精子细胞数明显增多。
       图1  正常大鼠生精细胞     端粒酶的表达（×1000）（略）       
       图2  正常大鼠生精细胞     端粒酶的表达（×400）（略）
       图3  衰老大鼠生精细胞     端粒酶的表达（×200） （略）       
       图4  用药大鼠生精细胞     端粒酶的表达（×200）（略）
       3  讨论
       睾酮的分泌受下丘脑垂体的调节，在维持生精功能、刺激生殖器官的生长发育、促进蛋白质合成(特别是肌肉和生殖器官的蛋白质合成)方面起重要作用；它还参与神经-内分泌-免疫网络的调节，并且与三大物质代谢、抗氧化、各种应激反应等密切相关。有研究发现性类固醇激素能改变成年动物神经元的结构［1］、增加动物下丘脑视前区神经元树突的长度［2］；雄激素还可以减少线粒体质子漏而促进线粒体氧化偶联，亦可通过刺激基因表达调节线粒体内各种酶的活性，从而促进ATP的生成和利用［3］。Vermeulen等［4］报道衰老时下丘脑促性腺激素释放激素(GnRH)神经元减少，GnRH分泌量下降，同时垂体促性腺激素细胞的体积密度随年龄增加进行性下降并且对GnRH刺激反应性下降，在下丘脑、垂体衰老变化的共同作用下，老年男性Leydig细胞功能降低，使睾酮合成和分泌能力下降，导致老年人血清中睾酮水平降低［5］。由于线粒体呼吸耗氧量占机体总耗氧量的90%，所以线粒体是活性氧（ROS）的主要生成场所，线粒体在产生能量的同时生成ROS。在正常生理情况下，体内存在清除自由基的防御系统，它包括SOD、谷胱甘肽过氧化物酶等，还有一些抗氧化物质VE、VC等。随着年龄增长，这些抗氧化防御体系活性降低，清除自由基能力下降，使体内ROS生成过量，引起蛋白质结构疏松、核酸键断裂与多聚核糖体解聚等多种变化，导致衰老的发生［6］。研究表明，SOD活性下降与衰老有密切关系［7］，它的含量减少或活性降低被认为是衰老的一项重要指标。端粒（Telomere）是真核细胞染色体末端一段特殊的DNA蛋白质复合体，在维护染色体的完整性，防止DNA降解、染色体缺失及抵御细胞内各种蛋白酶对染色体末端的异常操作有重要作用，并参与染色体在细胞核内的定位及基因表达调控［8］。端粒的长短和稳定性决定了细胞的寿命，并与衰老和癌变密切相关。影响端粒长度的因素很多，主要有端粒结合蛋白、端粒帽蛋白、端粒酶等，其中端粒酶是重要的延长端粒的因素。Ichiyoshi等［9］在研究时发现，细胞端粒严重缩短和端粒酶功能不足可以使细胞凋亡增加，并且他们认为端粒的缩短和端粒酶活性的下调是细胞凋亡的触发器；Zhang等［8］的研究认为，端粒酶活性的提高可以使细胞增殖增加，反之可以使凋亡增多。睾丸组织细胞成分比较复杂，在正常睾丸组织中部分生精细胞（精原细胞、精母细胞、精子细胞）即可以表达端粒酶活性［10］，并且各级生精细胞中端粒的长度是不同的，从精原细胞到精母细胞再到精子细胞，端粒是逐渐延长的。Kang等［11］的研究发现，24月龄大鼠与6月龄大鼠相比，血清睾酮含量和睾丸组织端粒酶活性明显下降，同时端粒酶组分之一的TP1的mRNA水平也相应下降，因此认为端粒酶活性是年龄依赖性的，随着年龄增加逐渐降低。《素问・金匮真言论》有记载：“夫精者，身之本也”，并认为“天癸竭，精少，肾藏衰，形体皆极”是衰老的主要原因, 所以历代医家多用补肾为主的方药来延年益寿。天年饮由刘河间《宣明论方》何首乌丸加味而成。何首乌丸本由何首乌、肉苁蓉、怀牛膝组成，能填精补髓、乌发延年。于此基础上加淫羊藿补肾壮阳以强筋骨，丹参活血化瘀以通心脉，茯苓健脾利湿以宁心神。诸药相配通调心脾肝肾四脏，而以肾为主。本研究发现，天年饮可明显提高衰老大鼠血清睾酮含量、SOD活性，并可明显改善衰老大鼠睾丸生精细胞端粒酶的表达，说明天年饮可显著改善衰老大鼠睾丸的功能，具有良好的延缓性腺衰老的作用。
       　　参考文献：
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       ［11］  Kang HK, Kim MS, Kim ND, et al. Down regulation of telomerase in rat during the aging process［J］. Mol Cells, 1999,9(3):286.
       基金项目：河北省科技厅资助项目（No.03547003D）
       (承德医学院基础医学研究所，河北 承德  067000；  承德医学院人体解剖学教研室，河北 承德  067000)