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       【摘要】 
       目的研究苍耳子提取物对鸭乙型肝炎的抗病毒作用。方法选1日龄北京雏鸭，人工感染鸭乙型肝炎病毒(DHBV)后随机分为5组：苍耳子提取物3个剂量组（1，0.1和0.01 g·kg-1·d-1），对照组采用生理盐水和拉米夫定(3TC，2 mg·kg-1·d-1)，每组6只，灌胃10 d，观察不同剂量苍耳子提取物抗DHBV作用效果。结果苍耳子提取物(1 g·kg-1·d-1)剂量组对延缓鸭肝病理改变有一定的作用，但对DHBV DNA无作用。结论苍耳子提取物对控制鸭乙型肝炎病毒引起的病理改变有一定作用。
       【关键词】  苍耳子提取物；鸭乙型肝炎病毒
       Experimental Study on Effect of  Fructus Xanthii Extract on Duck Hepatitis B Virus
       LIU Ying, WU Zhongming, LAN Ping
       1.Zhuhai Campus of Zunyi Medical College , Zhuhai 519041,China; 2.Department of Microbiology, Zunyi Medical College, Zunyi 563003,China
       Abstract：ObjectiveTo study the effects of extract from Fructus Xanthii duck hepatitis B virus.MethodsOne-day old ducks infected with DHBV were used as the hepatitis B virus infected animal model. The DHBV positive ducks were divided into 5 groups . Among the groups, three ones were treated with different concentrations of extract  from Fructus Xanthii（1，0.1 and 0.01 g·kg-1·d-1） for 10 days, control groups were treated with physiological saline and lamivudine(3TC, 2 mg·kg-1·d-1). ResultsThe high concentration of extract(1g·kg-1·d-1) could delay pathological changes of duck liver. But the three concentrations of extract had no effect on DHBV DNA in this experiment.ConclusionFructus Xanthii might delay pathological changes caused by Duck Hepatitis B Virus .
       Key words：Extraction from Fructus Xanthii;  Duck hepatitis B virus
       
       全世界现有乙型肝炎病毒性（HBV）感染者约4亿，每年50万～120万人死于慢性HBV感染及其导致的肝硬化和肝癌［1］，研发有效地抗病毒药物是当前科研工作者的重要任务。我国中草药资源丰富，毒副作用小，开展中草药抗HBV研究将成为今后我国科研工作者的研究方向之一。苍耳子始载于《千金·食治》，系菊科植物苍耳Xanthium sibiricum Patr的成熟带总苞果实，味辛苦，性温，有毒。在抗病毒研究上，曾有用苍耳子液治疗扁平疣获得较好疗效；姜克元［2］采用苍耳子醇提取物研究其抗疱疹病毒作用，结果表明，苍耳子提取液1∶5稀释可抑制病毒的生长，1∶10稀释可抑制100 TCID50。引起扁平疣的人乳头状病毒和疱疹病毒均属DNA病毒，乙肝病毒的核酸为DNA，苍耳子是否具有抗HBV的作用，本实验选用中草药苍耳子提取物，利用雏鸭作为动物模型，研究苍耳子提取物抗鸭乙型肝炎病毒的作用。
       1 材料
        试剂与动物：苍耳子提取物(本院自制)，鸭血清标本、DHBV阳性血清、斑点杂交试剂 (重庆医科大学)，拉米夫定［葛兰素威康（苏州）制药有限公司］；市售1日龄北京鸭。
       2 方法
       2.1 动物模型
       北京鸭经腹腔注射0.1 ml阳性血清，9 d后取血，分离血清，-70℃保存待检。
       2.2 药物治疗
       筛选出感染成功的阳性鸭30只，随机分为5组，每组6只。苍耳子提取物分高、中、低3个剂量组，分别为1，0.1和0.01 g·kg-1·d-1灌胃，1次/d，给药10 d；空白对照组选取为感染DHBV阴性雏鸭。空白对照组及模型对照组以生理盐水代替药物；拉米夫定（3TC）作为治疗对照组；以2 mg·kg-1·d-1灌胃，1次/d，给药10 d，分别用于药前(T0)，用药第5天(T5)，用药第10天(T10)和停药后第3天(P3)。自鸭颈静脉取血，分离血清，-70℃保存待检。
       2.3 检测方法
       采用赖氏法测定血清ALT/AST活性，斑点杂交法测积分光密度光度值(IOD)，并取停药3 d的鸭肝做病理切片，观察组织学改变。
       2.4 统计学处理
       用药组不同时间含量与用药前比较，采用成组t检验；用药组同一时间含量与病毒对照组比较，采用成组t检验。
       3 结果
       3.1 鸭肝HE染色切片用药前后的病理变化
       图1为正常鸭肝细胞；经DHBV感染后，鸭肝细胞（图2）出现明显空泡变性，胞浆疏松，汇管区可见炎细胞浸润，有点状出血、坏死；3TC鸭肝细胞（图3）形态正常；使用不同浓度苍耳子提取物的雏鸭，其肝细胞（图4～6）均有不同程度空泡变性、肿胀，部分可见汇管区及小叶间隔炎症细胞浸润，其中，苍耳子提取物高剂量组肝细胞水肿程度较轻，好于病毒对照组，随着苍耳子浓度降低，肝细胞病变程度逐渐加重，苍耳子提取物低剂量组肝细胞空泡变性程度较重，与病毒对照组无差异，并可见坏死、增生现象。
       3.2 T0，T5，T10及P3 鸭血清中DHBV DNA的变化
       将阳性雏鸭随机分为5组，T0→T5→T10→P3各时期用药组与同期病毒对照组分别采血检测血清中的DHBV DNA，斑点杂交实验结果显示：实验期间病毒对照组血清中DHBV DNA量较稳定，未见自然转阴者；阳性药物3TC组T5、T10与T0比较DHBV DNA量明显减少（P<0.05），而P3 DHBV DNA有明显反弹（P<0.05）。苍耳子提取物各组（1，0.1 ，0.01g·kg-1·d-1）对血清中的DHBV DNA无抑制作用（见图7,表1，图8）。表1  T0，T5，T10及P3血清中DHBV DNA 改变情况（略）
       4 讨论
        HBV感染抗病毒药物的筛选需要进行体内实验研究［3］。目前，鸭乙型肝炎病毒动物模型是卫生部规定的新药抗乙型肝炎病毒药效学评价的唯一动物模型［4］。鸭乙型肝炎病毒与人类乙型肝炎病毒同属嗜肝DNA病毒科，它们在形态、基因组结构及复制方式上有相似之处，鸭子是DHBV的自然感染宿主，感染后在病因或肝脏病理方面类似人类乙型肝炎［5］。DHBV感染雏鸭后9d，外周血DHBV上升，感染11 d达到高峰，至26 d才开始下降至较低水平。因此，适宜的给药时间在15 d左右［6］，该时期的DHBV阳性雏鸭是用作药物筛选理想的模型。本实验在雏鸭体内病毒血症最稳定的时间内进行，虽然最适给药时间较短，但能够模拟与人体感染HBV相似过程，我们认为仍可提示研究药物的抗HBV效应。
       
       HBV DNA是乙肝感染最直接、特异和灵敏的指标，我们利用斑点杂交技术检测鸭血清中DHBV DNA的表达，来判断药物治疗效应，结果提示，阳性对照药3TC组在用药期间能迅速降低血清中DHBV DNA的水平，但停药后病毒载量反弹明显，该现象与其在治疗HBV感染时的情况一致，其原因可能是［7，8］由于病毒感染了宿主细胞后，HBV mRNA和cccDNA整合在细胞核内，而3TC不能清除核内的mRNA和cccDNA。苍耳子提取物组血清中DHBV DNA水平在用药期间平稳，表明苍耳子提取物对DHBVDNA无抑制作用。
       
       经DHBV感染后，鸭肝细胞病理切片表现出明显空泡变性，胞浆疏松，汇管区可见炎细胞浸润，有点状出血、坏死；经3TC治疗的鸭肝细胞形态正常，表明3TC组有明显减轻鸭肝炎性改变的作用。不同浓度苍耳子提取物治疗后的鸭肝细胞，只有苍耳子提取物高剂量组肝细胞水肿程度较轻，好于病毒对照组，随着苍耳子浓度降低，肝细胞病变程度逐渐加重。说明苍耳子提取物高剂量组对DHBV造成的病理改变有一定的减轻作用，但作用不如3TC组明显。
       
       本研究表明，苍耳子提取物对延缓DHBV造成的病理改变有一定作用，对DHBV DNA无抑制作用，其机制仍需进一步探讨。
       【参考文献】
         　　［1］Lok AS,McMahon BJ. Chronic hepatitis B.Hepatology,2007,45 (2):507.
       
       ［2］姜克元, 黎维勇, 王 岚. 苍耳子提取液抗病毒作用的研究［J］.时珍国药研究, 1997,8(3):217.
       
       ［3］李常青, 刘妮. 苦参碱脂质体抗乙型肝炎病毒的体外实验研究［J］. 热带医学杂志, 2003, 3（1）:19.
       
       ［4］陈压西, 齐珍元, 黄爱龙. 碱性磷酸酶直接标记核酸探针检测血清中鸭乙型肝炎病毒DNA方法的建立及应用［J］. 重庆医科大学学报, 2003,28（3）: 140.
       
       ［5］胡权，杨东亮.鸭乙型肝炎病毒感染模型的研究进展［J］.实用肝脏病杂志, 2007,10(3):201.
       
       ［6］Lian Y, Tan J, Deng Z. Experimental study of shuangcao granule no.1 on duck hepatitis B virus in ducklings［J］. Chinese Journal of Integrated Traditional and Western Medicine, 2000,20(7): 530.
       
       ［7］苏海滨, 王慧芬, 季伟, 等. 拉米夫定与单磷酸阿糖腺苷联合应用抗-HBV的体外实验研究［J］. 中华实验和临床病毒学杂志, 2002, 16（1）:16.
       
       ［8］Zoulim, Fabien. Combination of nucleoside analogues in the treatment of chronic hepatitis B virus infection: lesson from experimental［J］. British Society for Antimicrobial Chemotherapy, 2005,55(5): 608.