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       【摘要】 
       目的探讨扶正化淤方通过影响基膜型基质金属蛋白酶活性而抗肝纤维化的作用机制。方法四氯化碳(CCl4)皮下注射与高脂低蛋白饲料复合建立大鼠肝纤维化模型。随机分为正常组、模型组与扶正化淤方药物干预组。药物组自造模之日起以扶正化淤方稀释液灌胃，共用药6周。HE染色观察肝组织炎性病理变化，天狼猩红染色观察肝组织胶原沉积，盐酸水解法测定肝组织羟脯氨酸含量，Western 印迹法分析肝组织α-SMA、Ⅳ型胶原、MMP-2、MMP-9、TIMP-2和MT-MMP1蛋白表达水平；明胶酶图法检测肝组织MMP-2/9活性。结果与正常大鼠比较，模型大鼠血清肝功能异常、肝组织炎症明显、肝组织IV型胶原表达与沉积增加，α-SMA、Ⅳ型胶原、MMP-2、MMP-9、TIMP-2和MT-MMP1蛋白表达升高，而MMP-2/9活性水平明显上升。扶正化瘀方显著改善模型大鼠血清肝功能、减轻肝脏炎症和胶原沉积；减少肝星状细胞活化；抑制Ⅳ型胶原蛋白表达和沉积；降低MMP-2、TIMP-2和MT1-MMP蛋白表达；抑制MMP-2/9活性。结论扶正化瘀方可通过抑制MMP-2的激活与活性水平，并减少Ⅳ型胶原沉积，而起到减轻肝组织的破坏与重构而发挥抗肝纤维化的作用。
       【关键词】  扶正化淤方 基质金属蛋白酶 基膜型 肝纤维化
       Effects of Fuzheng Huayu Decoction on Membrane-type Matrix-metalloproteinases Activty in CCl4 Induced  Rat Fibrotic Liver
       CUI Hongyan , LIU Chenghai, SUN Baomu , LIU Cheng
       （ Department of Pharmacology, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China; Institute of Liver Disease, Shuguang Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China）
       Abstract：ObjectiveTo investigate the effects of Fuzheng Huayu recipe (FZHY recipe) on the activity of membrane-type matrix-metalloproteinases and its mechanism in the treatment of liver fibrosis.  MethodsLiver fibrosis was induced in rats by injection of CCl4 subcutaneously and fed with high lipid and lower protein diet．Rats were randomly divided into 3 groups：normal，model control and Fuzheng Huayu decoction treated group. For the treated group，rats were administered with Fuzheng Huayu decoction by gavage for 6 weeks. Inflammation in liver was determined by HE staining,Collagen deposition in liver was studied by Sirius red staining,the content of hepatic hydroxyproline(Hyp) were measured with Jamall"s methods; protein expressions of α-SMA, collagen IV，MMP-2, MMP-9 and TIMP-2 were tested by Western blot, and MMP-2/9 activities were analyzed by gelatin zymography.ResultsCompared with normal group，abnormal liver function, obvious hepatic inflammation, excess collagen deposition, high protein expressions of collagen IV， MMP-2/9， TIMP-2 and MT1-MMP, and increased activities of MMP-2/9 were observed in model group. Compared with model group, FZHY recipe significantly improved the rat liver function, alleviated liver inflammation and the excess collagen deposition.In addition, it also significantly down-regulated the protein expression of collagen IV , MMP-2, TIMP-2 and MT1-MMP, and inhibited the activity of MMP-2.   ConclusionFuzheng Huayu decoction can down-regulate the activities of MMP-2 /9 and inhibit the activation of MMP-2，reduce the excess collagen IV deposition in liver tissue, and to alleviate the damage and regeneration of liver.
       Key words：FZHY Decoction；  MMP；  Membrane-type；  Liver Fibrosis
        肝纤维化是诸多慢性肝病的共同病理特点，以肝脏细胞外基质(extracellular matrix，ECM)代谢失衡，生成超过降解，并大量沉积于肝组织为特征。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）在ECM降解与肝纤维化逆转过程中起重要作用。扶正化瘀方具有良好的抗肝纤维化的疗效，其机理包括抗肝细胞脂质过氧化损伤、抑制肝星状细胞活化等［1，2］ 。既往我们也曾报道该方对间质性MMPs活性的影响［3］ 。本研究制备CCl4肝纤维化模型，旨在探讨扶正化淤方通过影响基膜型MMPs活性和酶原活化调节因子而抗肝纤维化的作用机制。
       1  材料
       1.1  动物 
       Wistar雄性大鼠33只，清洁级，体重(150±10)g，中科院上海实验动物中心提供，上海中医药大学实验动物中心清洁级饲养。
       1.2  药物
       扶正化淤方由丹参、桃仁、虫草菌丝、松黄粉、五味子、绞股蓝组成，浸膏干粉由上海现代中医药技术发展公司提供，制备成含276 mg生药·ml-1的流浸膏灌胃液。
       1.3  试剂 
       四氯化碳(CCl4)分析纯，购自上海华东试剂公司。羟脯氨酸(hydroxyproline, Hyp)标准品，分析纯，日本ナカラィテスヶ株式会社产品。小鼠抗人α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)单克隆抗体，Dako公司产品。兔抗人MMP-2多克隆抗体，购自武汉博士德生物工程公司。小鼠抗人MMP-9和金属蛋白酶组织抑制物-2（tissue inhibitors of metalloproteinase-2，TIMP-2）单克隆抗体、小鼠抗人Ⅳ型胶原单克隆抗体，美国NeoMarker公司产品。小鼠抗人膜型基质金属蛋白酶-1（membrane type-1 matrix metalloproteinases，MT1-MMP）单克隆抗体，Chemicon公司产品。辣根过氧化物标记驴抗兔抗体和辣根过氧化物标记驴抗鼠抗体，美国Amersham Pharmacia Biotech公司产品。化学荧光底物(ECL)为Pierce公司产品。明胶，美国Amersco公司产品。
       2  方法
       2.1  模型制备 
       首次皮下注射100％CCl4溶液0.5 ml／100 g，其后40％ CCl4橄榄油溶液0.3 ml／100 g，2次/d，共6周。第1～2周给予高脂低蛋白饲料(79.5％玉米粉、20％猪油、0.5％胆固醇)，而后给予纯玉米饲料。正常对照组皮下注射等量橄榄油，普通饮食。
       2.2 分组用药 
       
       大鼠分为正常组(5只)、模型组(13只)与扶正化瘀方药物干预组(15只)。药物干预组灌胃扶正化瘀方药液，以10 ml／kg大鼠体重(相当于65 kg等体重成人等效量)的剂量，自造模之日起，1次/d，共用药6周，其余两组灌同容积的生理盐水。
       2.3  肝脏组织病理学观察 
       HE染色和天狼猩红胶原染色，光镜观察。
       2.4  血清肝功能测定 
       试剂盒方法检测血清ALT活性、AST活性、Alb和TBil水平。
       2.5  肝组织Hyp含量测定 
       盐水水解法，参照Jamall氏法［4］。
       2.6  肝组织α-SMA、Ⅳ型胶原、MMP-2、MMP-9、TIMP-2和MT-MMP1蛋白表达
       采用Western印迹法。 取100 mg肝组织加裂解液(0.15mol／L NaCl，1%NP-40，1% SDS，50 mmol／L Tris pH 7.2，5 mmol／L EDTA，1 mmol／L PMSF)4℃匀浆。12 000r／min离心10 min，提取肝组织总蛋白，考马斯亮蓝试剂盒(南京建成)测定总蛋白含量。取50 μg总蛋白，变性后进行10％ SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白转移至硝酸纤维素膜，经5％脱脂奶粉／TBS溶液封闭后，分别加入以下特异性抗体：分别与α-SMA（1∶200）、Ⅳ型胶原（1∶100）、MMP-2（1∶133）、MMP-9（1∶100）、TIMP-2（1∶100）、MT1-MMP（1∶100）抗体4℃孵育过夜，洗涤后以偶联HRP的抗小鼠抗体(1∶5 000)结合，ECL显影曝光。每组至少重复3次实验，计算机扫描，图像分析软件半定量目的蛋白表达水平。
       2.7 肝组织MMP-2/9活性检测 
       采用明胶酶图法［5］。取100 mg肝组织置0.9 ml匀浆缓冲液（1 mol/L Tris-HCl, 0.5 mol/L NaCl, pH7.0）中匀浆。取含30μg总蛋白的匀浆液进行含0.1%明胶的8% SDS-PAGE还原但非变性电泳。电泳结束后，凝胶置于洗脱液（2.5%Triton X-100, 50 mmol/L-Tris-HCl, 5 mmol/L CaCl2, 1 μmol/LZnCl2，pH7.6）中洗脱2次，45 min/次; 再以漂洗液（50 m mol/L Tris-HCl, 5 mmol/L CaCl2, 1μmol/L ZnCl2, pH7.6）漂洗2次，30 min/次。其后，将凝胶置于孵育液（50 mmol/L Tris-HCl, 5 mmol/LCaCl2, 1 μmol/L ZnCl2, 0.02% Brij-35, pH7.6）中37℃孵育18 h。孵育结束后经考马斯亮蓝染色液染色，可显示出MMP-2和MMP-9位于蓝色背景上的透亮带。电泳凝胶在灰阶模式下扫描，应用复日FR-980生物电泳图象分析系统测定凝胶中的MMPs活性条带。
       2.8 统计学方法 
       计量资料用±s表示，计算机统计软件SPSS 11.0中的ANOVA程序进行单因素方差分析，P<0.05为具有显著性差异。
       3  结果
       3.1  扶正化瘀方对模型大鼠肝脏炎症与纤维化的影响 
       病理组织染色发现，与正常组比较，模型大鼠可见大面积出血性坏死并见大量肿胀肝细胞，汇管区明显增宽并有炎性细胞浸润，肝小叶结构紊乱；胶原纤维胶原沉积增多，纤维间隔和假小叶形成。生化检测发现模型组大鼠肝组织Hyp水平较正常组明显升高；血清ALT、AST活性、TBil与Alb明显升高。与模型组比较，扶正化瘀方组大鼠肝组织炎性细胞浸润与坏死明显减轻，胶原纤维沉积减少；肝组织Hyp含量显著降低；血清ALT、AST活性有显著下降，TBil与Alb变化不明显。结果见表1。表1  扶正化瘀方对模型大鼠血清肝功能和Hyp含量的影响（略）与模型组比较，* P＜0.05, ** P＜0.01
       3.2  扶正化瘀方对模型大鼠α-SMA蛋白表达的影响 
       模型组大鼠肝组织α-SMA表达明显增加，而扶正化瘀方用药后，α-SMA表达基本下降至正常水平（见图1）。
       
       3.3  扶正化瘀方对模型大鼠Ⅳ型胶原蛋白表达的影响  与正常组比较，模型组大鼠肝组织IV型胶原表达明显增加，而扶正化瘀方明显降低模型大鼠肝组织异常升高IV型胶原蛋白的表达（见图2）。
       
       3.4  扶正化瘀方对模型大鼠MMP-2/9蛋白表达的影响  与正常组比较，模型组MMP-2蛋白表达变化略有升高，MMP-9蛋白表达显著升高。与模型组相比，扶正化瘀方对纤维化肝脏的MMP-2表达有所下降，而MMP-9蛋白表达变化不明显（见图3）。
       
       3.5  扶正化瘀方对模型大鼠肝组织MMP-2和MMP-9活性的影响  与正常组比较，模型组大鼠肝组织MMP-2和MMP-9活性明显升高。扶正化淤方治疗组显著降低模型大鼠肝组织MMP-2和MMP-9活性，对MMP-9活性影响更为明显(见图4) 。
       3.6  扶正化瘀方对肝组织TIMP-2蛋白表达的影响 与正常组比较，模型组大鼠肝组织TIMP-2蛋白表达明显升高，扶正化瘀方组明显减少模型大鼠肝组织的TIMP-2蛋白表达(见图5)。
       
       3.7 扶正化瘀方对肝组织MT1-MMP蛋白表达的影响模型组大鼠肝组织MT1-MMP蛋白表达均较正常组明显升高。扶正化瘀方用药后，大鼠肝组织MT1-MMP表达有所下降(图6)。
       
       4  讨论
        基膜性MMPs包括MMP-2和MMP-9，主要降解基底膜的重要成分——天然Ⅳ型胶原、明胶（变性的间质性胶原）和Ⅴ型胶原，从而直接参与调节ECM的合成与降解的动态平衡，与肝纤维化发生、发展密切相关。既往研究表明［6，7］，肝纤维化早期，MMP-2和MMP-9活性升高，降解窦周间隙Ⅳ型胶原，破坏基底膜正常结构，启动了肝纤维化的发生；而对于肝纤维化形成过程中基膜性MMPs表达持续升高，认为其意义则在于参与降解过度沉积的胶原及促进肝纤维化的逆转。然而近年来对MMP-2在肝纤维化中的作用又有了新的认识，研究发现肝脏MMP-2主要来源于肝星状细胞（hepatic stellate cell, HSC），而肝细胞的过氧化损伤可通过ERK/PI3K等信号途径，上调MMP-2 活性，从而促进HSC 的增殖活化与迁移［8］。我们也曾动态观察肝组织MMP-2 活性［9］，发现MMP-2 活性与肝脏炎症、HSC活化密切相关，变化趋势一致。这说明肝纤维化时MMP-2 活性升高主要由于炎症刺激与HSC活化，并非仅仅是机体对纤维增生的一种反馈性调节机制，而MMP-2活性的升高又可进一步促进正常基膜成分的降解，破坏正常肝组织结构，促进HSC活化，导致肝脏结构重构与纤维化形成。肝纤维化时MMP-2 活化和HSC活化互为因果，形成恶性循环，共同促进了肝纤维化的进程。本实验发现CCl4模型大鼠肝组织MMP-2/9蛋白表达和活性显著升高，HSC活化标志物α-SMA表达也明显增高，而用扶正化瘀方后可显著抑制MMP-2/9的活性水平并减少HSC的活化，提示该方可通过抑制MMP2/9活性而防止肝组织正常基膜结构的破坏，阻止肝组织结构重构以及肝纤维化的进一步发展。
        TIMP-2和MT1-MMP在MMP-2活性调节中具有重要作用［10］。MMP-2酶原激活首先要形成MMP-2、MT1-MMP和TIMP-2三联体复合物才能进一步活化。TIMP-2对MMP-2作用较为复杂，高浓度时抑制MMP-2的活性，低浓度时则通过与MT-MMP1结合而促进MMP-2酶原的活化。本研究发现，造模组TIMP-2和MT1-MMP蛋白水平均显著升高，这可导致模型大鼠MMP-2激活增多，活性升高；而扶正化瘀方可使二者表达明显下降，应该是通过减少了三联体复合物的形成而起到抑制MMP-2活性的作用。
        Ⅳ型胶原是MMP-2/9的底物，既然在肝纤维化过程中 MMP-2/9活性升高，那么Ⅳ型胶原理应减少。其实在肝纤维化过程中，由于HSC过度增殖活化，Ⅳ型胶原生成增多，超过降解，在肝脏中异常沉积，与增生的间质性胶原共同参与了肝纤维化的进展过程。我们既往经免疫组化染色发现二甲基亚硝胺肝纤维化模型肝组织中肝窦及小叶Ⅳ型胶原蛋白表达均明显增加［11］，蛋白印迹法也进一步证实Ⅳ型胶原蛋白在肝纤维化过程中表达增加。本实验应用CCl4造模，经蛋白印迹法检测亦发现，肝纤维化形成过程中Ⅳ型胶原蛋白表达显著升高，其变化与α-SMA表达水平和肝脏总胶原沉积变化相同，即与肝纤维化程度一致。扶正化瘀方能明显抑制Ⅳ型胶原表达，可能是由于该方能够抑制HSC的活化，而HSC是Ⅳ型胶原的主要来源。
        总之，本实验发现扶正化瘀方可通过改善肝脏炎症、减少HSC活化与调节酶原活化因子表达而抑制MMP-2活性水平，同时能抑制Ⅳ型胶原在肝脏的沉积，从而减轻肝组织的破坏与重构，这是扶正化瘀方抗肝纤维化的重要作用机制之一。
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