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       【摘要】 
       目的探讨桂枝甘草汤提取物组分对心肌缺血再灌注心律失常的作用。方法结扎大鼠冠状动脉左前降支15 min再灌注1 h，监测心电变化，并检测心肌组织ATP酶活性及NO含量。结果桂枝甘草汤提取物水组分、30醇组分有对抗心肌缺血再灌注损伤所致心律失常的作用，并且可提高大鼠心肌组织ATP酶活性和NO含量，与模型组比较有显著差异（P<0.05或P<0.01）。结论桂枝甘草汤有效组分可能是通过提高ATP酶的活性、增加NO的含量减轻缺血再灌注对心肌的损伤。
       【关键词】  桂枝甘草汤 心肌缺血再灌注 心律失常 ATP酶 一氧化氮
       Effect of Ramuli Cinnamomi and Glycyrrhizae Decoction (RCGD) and its Extractive Composition on Myocardial Ischemia-reperfusion Arrhythmia in Rats
       LI Ji ,ZHAO Weiguo, LI Shengzhi ,YU Hai
       （Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine,Haerbin,150040, China）
       Abstract：ObjectiveTo investigate the effect of Ramuli Cinnamomi and Glycyrrhizae Decoction (RCGD) and its extractive composition on myocardial ischemia-reperfusion arrhythmia in rats. MethodsThe myocardial ischemia-reperfusion model was induced by 15min coronary occulusion and 60min reperfusion in open-chest anesthetized rats. The changes of electrocardiogram were monitored，myocardial ATPase activity and NO content were detected.ResultsRCGD and its extractive composition of water and 30% ethanol had protective effect on myocardial ischemia- reperfusion injury- induced arrhythmia and, increase ATPase activity and NO content, and there were significant significant differences between drug groups and control group（P<0.05 or P<0.01）. ConclusionEffective components of RCGD may relieve myocardial ischemia- reperfusion injury by increasing ATPase activity and NO content.
       Key words：Ramuli Cinnamomi and Glycyrrhizae Decoction;   Myocardial ischemia-reperfusion ;   Arrhythmia;   ATPase;   Nitric oxide
        桂枝甘草汤为温补心阳的基础方，出自汉·张仲景《伤寒论·辨太阳病脉证并治》篇“发汗过多，其人叉手自冒心，心下悸，欲得按者，桂枝甘草汤主之”。 现代临床多以本方为基础方用于治疗“心悸”等相关病证，更有不少临床报道表明本方对不同类型心律失常具有较好的疗效。前期研究表明桂枝甘草汤提取物组分对多种药物诱发心律失常动物模型有对抗作用，本次研究从大鼠心肌缺血再灌注模型入手，探讨桂枝甘草汤提取物组分对心肌缺血再灌注心律失常的影响，以期更全面地揭示桂枝甘草汤提取物组分的抗心律失常作用。
       1  器材
       1.1  实验仪器MedLab型多道生物信号分析系统（南京美易科技有限公司）；小动物呼吸机（四川医疗器械厂）；电子分析天平（德国Sartorius）；KDC型离心机（广州会城无线电厂）；内切式组织匀浆器（浙西机械厂）；721型分光光度计（四川分析仪器厂）；电热恒温水浴箱（北京西城区医疗器械厂）。
       1.2  动物Wistar大鼠，96只，雄性，体重280～300 g，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供。
       1.3  试剂及药物氨基甲酸乙酯（上海化学试剂公司）；ATP酶活性测试盒（定磷法）；NO试剂盒（硝酸还原法），总蛋白测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）；心律平批号041102.（山东省莒南制药厂 ）；桂枝甘草汤提取物各组分（自制）。
       2  方法
       2.1  分组及给药Wistar大鼠，96只随机分成8组，即：桂枝甘草汤提取物水组分组（简称水组分），桂枝甘草汤提取物30醇组（简称30醇组），桂枝甘草汤提取物60醇组（简称60醇组），桂枝甘草汤全方组（简称全方组），桂枝甘草汤挥发油组（简称挥发油组），模型组，阳性药（心律平）对照组，假手术组。每组12只。给药量：桂枝甘草汤及其各提取物组分给药量相当于5.58 g/kg生药量；模型组给予等体积蒸馏水，阳性对照组按用量40.5 mg/kg给药。
       2.2  心肌缺血再灌注心律失常动物模型的建立将大鼠腹腔注射25％乌拉坦6 ml/kg进行麻醉，背位固定，四肢皮下插入针状电极，连接II导联心电图；启动MedLab多道生物信号采集处理系统监测心电情况；行气管插管用呼吸机人工控制呼吸，频率65～70次/min，潮气量40～60 ml/kg根据呼吸频率和深度调整参数。左胸正中旁切口开胸，暴露心脏，轻压右侧胸廓，挤出心脏，剪开心包膜，用棉签拨起左心耳，在左心耳与肺动脉圆锥下2～3 mm处，用穿有3/0丝线的6号小圆针穿过冠状动脉左前降支，然后迅速将心脏送回胸腔，稳定10 min，将3 mm×3 mm聚乙烯管置于冠状动脉左前降支与结扎线之间，结扎后关胸，停止人工呼吸。15 min后，剪断结扎线，取出聚乙烯管，直至再灌注60 min。以收紧结扎线后心电图S-T段上升，放松后S-T段下降1/2以上为模型成功。
       2.3  指标观察及测定
       2.3.1  心律失常大鼠心电图及心律失常的观察室性早搏(VP)：提前发生的QRS波群，无P波；QRS波形宽阔畸形，较正常高且时间长；T波与QRS波群主波方向相反。室性心动过速(VT)：室性早搏连续快速出现即形成VT≥4个。室颤(VF)：心电图波形、振幅与频率均极不规则，无法识别QRS波群、ST段与T波。用MedLab生物信号处理系统监测心电图的变化，并分别记录室性早搏数( VP )，室性心动过速持续时间(VT)及室颤持续时间(VF)。张立克等［1］的方法对缺血再灌注期间出现的室性心律失常(VA)分别进行评分，具体评分标准为：0分，无VA或有<5次的室性早搏(VP)；1分，仅有≥5次VP；2分，仅有一阵<60的室性心动过速(VT)；3分，有一阵≥60或多阵累计<60的VT；4分，多阵VT，累计>60；5分,持续超过180 s的VT或其它心律失常，和(或)超过10s的可逆性VF；6分，不可逆性VF或停搏（CA）。
       2.3.2  心律失常大鼠组织中蛋白含量、ATP酶活性及NO含量测定 大鼠冠状动脉结扎75 min后，颈动脉放血，处死，收集血液，静置于4℃，2 h后离心，取血清；另外，取左心室广泛苍白缺血区心肌，在冰水中用内切式组织匀浆器制成10% (W/V)生理盐水组织匀浆(匀浆时间20 s/次，间歇20 s，连续5～7次)，3 000 r/min和1 500  r/min离心15 min，取上清液，用ATP酶、总蛋白测定试剂盒及NO试剂盒按照操作规程测定。ATP酶为定磷法，总蛋白测定为考马斯亮蓝法，NO用硝酸还原法。
       2.4  数据处理及统计学分析 各组数据用±s表示，采用t检验来检验各资料组间的统计学显著性差异，P<0.05有显著性差异，P<0.01为有非常显著性差异。用SPSS13.0统计分析软件进行数据处理。
       3  结果
       3.1  桂枝甘草汤各组分对缺血再灌注损伤致大鼠心律失常的影响如表1所示，模型组与假手术组比较心律失常评分有显著差异（P<0.01）；水组分、30醇组、全方组、阳性药组对缺血再灌注损伤致大鼠心律失常有明显的对抗作用，与模型组比较差异显著（P<0.05或P<0.01）。表1  桂枝甘草汤各组分对缺血再灌注损伤致大鼠心律失常的影响（略）与模型组比较，*P<0.05,**P<0.01
       3.2  桂枝甘草汤各组分对缺血再灌注损伤大鼠心肌ATPase活性的影响
       3.2.1  对Na+-K+-ATPase活性的影响模型组与假手术组比较有显著下降（P<0.01），说明缺血再灌注后Na+-K+-ATPase活性有显著下降；水组分、30醇组、全方组、阳性药组对缺血再灌注后大鼠心肌细胞Na+-K+-ATPase活性有明显提高作用(P<0.05或P<0.01)。结果见表2。
       3.2.2  对Ca2+-Mg2+-ATPase活性的影响模型组与假手术组比较有显著下降（P<0.01），说明缺血再灌注后Ca2+-Mg2+-ATPase活性有显著下降；水组分、30醇组、60醇组、全方组、阳性药组对缺血再灌注后大鼠心肌细胞Ca2+-Mg2+-ATPase活性有明显提高作用，与模型组比较差异显著(P<0.05或P<0.01)。结果见表2。表2  桂枝甘草汤各组分对缺血再灌注损伤（略）与模型组比较，*P<0.05,**P<0.01
       3.3  桂枝甘草汤各组分对缺血再灌注损伤大鼠心肌NO含量的影响如表3所示，缺血再灌注后NO含量有显著下降，模型组与假手术组比较差异显著（P<0.01）；阳性药组、全方组、水组分、30醇组与模型组比较NO含量有明显提高，与模型组比较差异显著（P<0.05或P<0.01）。表3  桂枝甘草汤各组分对缺血再灌注损伤大鼠心肌NO含量的影响（略）与模型组比较，*P<0.05,**P<0.01
       4  讨论
        心肌细胞几乎全部依赖有氧代谢ATP以供细胞生存及做功的需要，ATP的产生和储存在线粒体进行，线粒体中ATPase的活性在维持心肌细胞及内钙镁的稳态起着重要的作用，心肌缺血缺氧时，线粒体中钠、钙、镁的含量出现不同程度的改变，Mg2+含量的减少以及Na+、Ca2+含量增多可引起能量代谢障碍，从而使依赖于ATP的Ca2+-Mg2+-ATPase活性下降；心肌细胞膜Ca2+-Mg2+-ATPase酶是将钙离子主动泵出细胞外的主要途径，其活力下降将致心肌细胞内钙超负荷而引发心律失常［2］。缺血和再灌注损伤进一步加重时，氧自由基的损伤作用及细胞能量的耗竭，将使Na+-K+ -ATPase活性显著降低，进一步使细胞外K+增多，且增多的K+分布并不均匀，自缺血中央区至边缘区逐渐下降［3］，这种局部K+分布不均匀可促进缺血再灌注性心律失常的发生；同时，局部高钾而去极的交感末梢释放的NE递质增多，引起局部的浦氏细胞的自律性增高，可导致室性心律失常。
       
        目前认为NO抗缺血再灌注损伤性心律失常的可能机理为: NO能调节冠脉血流量，通过增加心肌细胞灌流而减轻室性心律失常发作的严重程度，并能降低心肌收缩力，减少心肌耗氧量，提高心肌细胞氧供需比，激活鸟苷酸环化酶，调节心肌细胞内cGMP含量，通过cGMP依赖的蛋白激酶减少缓慢内向钙电流，产生β-肾上腺素能调节作用，或阻滞通过肌纤维膜L型钙通道(Cal)的钙离子内流，减少心肌缺血再灌注时的钙超载，抑制心律失常的发生，或通过减少心脏去甲肾上腺素的释放，调节心脏神经元，发挥其抗心律失常作用［4］ 。
        实验结果表明在心肌缺血再灌注过程中心肌组织ATP酶的活性有显著下降，同时心肌组织中NO的含量也明显下降，这与前人的研究相一致［5，6］。而与模型组相比桂枝甘草汤及其提取物水组分、30醇组分可明显的提高缺血再灌注损伤中心肌Na+-K+ATPase活性，桂枝甘草汤及其提取物水组分、30醇组分、60醇组分可明显提高Ca2+-Mg2+ATPase的活性。桂枝甘草汤及其提取物水组分、30醇组分可明显的提高缺血再灌注损伤中心肌NO的含量。说明桂枝甘草汤及其有效组分可能是通过提高ATP酶的活性改善心肌细胞能量代谢以及调节细胞内外离子浓度，以及增加NO的含量发挥NO的保护心肌的作用，来减轻缺血再灌注对心肌的损伤。
       【参考文献】
         　　［1］张立克，王 雯，陈瑞芬，等.细胞色素P450对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响［J］.中国病理生理杂志，1999，15 (6)：518.
       
       ［2］殷惠军，罗 兰，蒋跃绒，等.地精子皂甙抗缺血再灌性心律失常的作用机制研究［J］.中西医结合心脑血管病杂志，2005，3（1）：39.
       
       ［3］Coronel R, Fiolet JM,Wilma Schopoman FJ. Distribution of extracellular potassium and its relation to electrophysiologic changes during acute myocardial ischemia in the isolated perfused porcine heart［J］.Circulation, 1998, 77: 1125.
       
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       ［6］Hidenori G，Yoshihiko F，Kimikazu H，et a1．Nitric oxide release from coronary vasculature before, during, and following cardioplegic arrest［J］.World J Surg，1999，23：1249.