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       【关键词】  基因型 HBV 基因变异
        为明确乙型肝炎病毒(HBV)基因变异在肝炎发病机理中的作用一般需要克隆后测序，动态比较肝炎发病前后的HBV核酸序列变。但是克隆后测序受混合毒株干扰，不能准确反映优势毒株的变化。因而我们研究了应用PCR产物限制性片段长度多态性(RFLP)方法与克隆后测序相给合，探讨其在重型肝炎发生前后HBV S基因变异研究中的价值。
       1   材料与方法
       1.1  研究对象1例重型乙型肝炎(重肝)患者，男性，33岁。根据1995年全国病毒性肝炎会议肝炎诊断标准确诊;收集发病前6个月及发病住院时的2份血清进行分析。
       1.2  血清HBV DNA扩增、克隆与测序常规抽提血清DNA，用聚合酶链反应(PCR)扩增HBV S基因序列，PCR产物直接克隆入Pgem-T报告Easy质粒中(Promepa,USA),每份标本随即挑选3个阳性克隆进行全自动测序(ABI 377 DNA Automatic Sequencer, Perkin-Elmer，CA), PCR及测序引物见表1。用DNA SIS软件处理分析测序结果。表1  HBV基因PCR扩增和测序所用引物（略）
       
       1.3   RPLP分析HBV基因型用引物对YS1和YS2进行PCR扩增S基因nt48-633之同片段，长度为586bp。以 B、C为优势基因型的地区,PCR产物先经限制性内切酶Sty1和Bsr平行酶切，疑胶电泳后可明确鉴定B型(127bp，459bp)和C型（333bp，253bp）,并可区分A型和D型。根据需要再经Hpa2或Dpnl酶切分型。
       2  结果
       RFLP分析各克隆序列HBV基因型，重肝前后标本均为B、C混合型，以B型为主。应用s区序列同源性比较方法［1］，分析克隆基因型。重型肝炎前3个克隆l株(LI)为C基因型(血清型adr)，2株(L2.L3)为B基因型；重型肝炎发生后3个克隆(H1、H2、H3)均为B基因型（血清目 adu）。
        
        HBV S基因克隆后序列比较分析L1株血清型为adr基因型为C型，与中国C基因型流行株标准参照序列比较，前S/S区共有11个位点变异，S区nt 668-669间有31bp的插入变异；分析2份血血清克隆(Ll-L3与Hl-H3)的差异.有170个位点不同；仅分析优势B基因型毒株(L2-L3与H1-H3)，存在54个位点差异；C基因型克隆(L1)与B基因型克隆间有87个位点的差异(图1)。
       3  讨论
       3.1  动态监测HBV变异的克隆后测序方法的弊端HBV现分为7种基因型［2］。不同基因型间序列差异较大（8%异质性)。由于慢性HBV感染易出现野毒株和变异株混合感染及不同基因型毒株感染，在分析不同克隆株时就极可能因以上不同基因型混合毒株感染而使结果判断错误，易将不同基因型间毒株序列差异误判为基因位点改变或基因变异。因此，在分析克隆测序结果前需判断该标本是否存在不同基因型的混合毒株感染，以及确定为何种基因型毒株感染。
       3.2   RFLP对HBV基因型设计本设计是基于分析GenBank中189株全序列(24株A型、35株B型、85株C型、37株D型、4株E型和3株F型)S基因nt 48-633序列对齐比较，发现限制性内切酶sty1存在于多数C型序列中；Bsr1第174位酶切位点是B型独有的。E、A型Bsr1酶切位点位于第348位(301 bp, 285 bp)。 Hpa2仅在E型第nt552位有酶切位点(81 bp,504 bp)。Dpn1酶可准确鉴定90%的F型和剩余的少数A、C型：C型中无该酶位点；B、E及D型酶切位点在nt337位；半数A型有2个位点(nt 131和nt337位)；在F型中有2个位点(nt 337和nt 593位)。D基因型全长在nt 2851后缺失33个碱基。用YPl及Yp3引物扩增前S1基因，可鉴定D基因型:非D基因型PCR产物长度为222bp，D基因型长度为189 bp。不同地区可根据其流行株基因型不同，选用不同内切酶组合。由于我国流行的HBV主要是B、C型［3］，我们选用了sty1和Bsr1联合酶切鉴定不同克隆基因型。
       
       3.3   RFLP在HBV S基因克隆分析中的应用评估RFLP先行分析2份血清中HBV毒株，确定为以B基因型为优势的B/C型混合感染。分析2份血清分离的克隆间的核酸序列差异，有170个位点不同；而去除非优势毒株C基因型L1克隆，仅分析优势B基因型毒（血清亚型为adw)，结果有54个位点差异。显然C基因型克隆(L1)与B基因型克隆间有87位点的差异属于B/C基因型间的差异。由于慢性HBV感染毒株多以混合形式存在［4］，动态监测同一毒株基因变异在技术上尚难做到，代之以监测优势毒株基因变异却是可行的。随机挑取少量的克隆株有可能是非优势毒株，而选取大量克隆株又会成倍增加工作量和研究费用。为解决这一矛盾，我们选取另一思路采用简便快捷方法先确定优势毒株基因型，以此为参照应用于克隆株的分析，筛除非优势毒株对序列分析的干扰，使结果分析更实际、准确。这一思路方法在本研究应用中因确定了L1株为C基因型株先行去除，只分析优势B基因型毒株，大大简化了分析的难度与偏差。
       【参考文献】
         　　［1］Dkamoto H，Tsuda F，Tanaka T，et al.Typing hepatitis B virus by homology in nucleotide sequence：comparison of surface subtype［J］.J Gen Virol，1988，69：2575.
       
       ［2］Stuyver L，De Gendt S，Van Geyt C，et al.A new genotype of hepatitis B virus：complete geuome and phylogenetic relatedness［J］.J Gen Virol，2000，81：67.
       
       ［3］范金水，庄 辉，李永贵，等.我国八大城市HBsAg阳性和阴性乙型肝炎患者的病毒血清和基因型分析［J］.中华微生物学和免疫学杂志，1998，18（1）：88.
       
       ［4］Hou J，Lau GKK，Cheng CC，et al.T1762A1764Variant of the basal core promoter of hepatitis B virus ：serological and clinical correlations in Chinese patients［J］.1999，19（5）：411.
       
       ［5］郭亚兵，侯金林，戴 炜，等.乙型肝炎病毒中国株全基因参照全序列初步建立［J］.中华微生物学和免疫学杂志，1999，19（3）：197.