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       【摘要】 
       目的观察大黄虫丸经旁分泌途径对大鼠肝星状细胞增殖及其表达TGF-β1 基因的影响。　方法采用Nycodenz 分离液非连续密度梯度离心法同步分离急性CCl4 损伤模型大鼠和正常大鼠肝的枯否细胞（KC）和星状细胞（HSC）。在制备正常鼠血清和大黄虫丸药物血清的基础上，将它们分别加入KC 培养板内作用48 h 后制备成正常鼠KC 条件培养液（NKCCM）和损伤鼠KC 条件培养液（KCCM）。将NKCCM 和KCCM 作用于活化的HSC 24 h 后，采用MTT 法和3H-TdR 掺入法检测HSC 增殖的变化；采用半定量RT-PCR 法扩增TGF-β1 mRNA 以检测HSC 表达TGF-β1 基因的情况。　结果旁分泌组各组的HSC 增殖幅度及TGF-β1 基因的相对表达量较正常对照组NKCCM 组均明显增加（P＜0.05或0.01）。同时旁分泌组中，含药血清作用的5%，10%和20% KCCM 组较无药物血清作用的0% KCCM 组HSC 的增殖能力及TGF-β1 基因的相对表达量则下降，且随药物浓度的升高逐渐降低，其组间差别有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。结论大黄虫丸可明显抑制经旁分泌途径活化的大鼠HSC 的增殖及TGF-β1 基因的表达，且其抗肝纤维化效应与药物剂量间存在一定的依赖关系。
       【关键词】  大黄虫丸　肝纤维化　 肝星状细胞　旁分泌
       Intervention of Dahuang Zhechong Pill on Early Hepatic Fibrosis via Paracrine Pathway
       CHENG Jiamao,  PAN Zhiheng,  XIE Yao,  HE Hongwen, QU Huaigang
       1 .Department of Anatomy, Basic Medical College of Dali University, Dali 671000, China;2 .Department of Traditional Chinese Medicine, The 3rd Affiliated Hospital of Sun Yat-sen university, Guangzhou 510630, China. 3 .Department of Anatomy, Basic Medical College of Sun Yat-Sen University, Guangzhou 510080, China
       Abstract：ObjectiveTo observe the effects of Dahuang Zhechong Pill on the proliferation of rat hepatic stellate cells(HSCs) activated by paracrine pathway and the expression of transforming growth factor-beta 1(TGF-β1) gene.MethodsThe CCl4-injured and normal rat Kupffer cells(KCs), hepatic stellate cells were separated by non-continuous density gradient centrifugation of Nycodenz medium. After the common rat and the drug sera prepared, they were added respectively into Kupffer cell culture plates for normal Kupffer cells conditioned medium(NKCCM) and injured rat Kupffer cells conditioned medium(KCCM) after 48 h. We observed the changes of proliferative HSCs by the methods of MTT and 3H-thymidine(3H-TdR) incorporation assay, and the expression of TGF-β1 gene in HSCs by semi-quantitative RT-PCR when HSCs were actived for 24 h by those conditioned medium.ResultsIn all paracrine groups, the multiplication of HSCs and the relative expression of TGF-β1 gene were increased markedly compared to normal control group(P＜0.05 or P＜0.01), and gradually decreased in all drug and no drug serum groups with elevated drug concentration.There had significant diferences among all groups.ConclusionDahuang Zhechong Pill can obviously inhibit the proliferation of rat HSCs activated by paracrine pathway and the expression of TGF-β1 gene in HSCs and deerease hepatic fibrosis in  a concentration-dependent manner.
       Key words： Dahuang Zhechong Pill;   Liver fibrosis;   Hepatic stellate cell;  Paracrine
       
       肝纤维化是从各型慢性肝病转化为肝硬化的一个重要病变过程，有效逆转肝纤维化已成为防治肝硬化的重要手段。它是一个伴随肝内细胞外基质（ECM）增多和沉积的瘢痕化过程，在细胞和分子水平上以HSC 的活化、转化生长因子β1 （transforming growth factor-beta 1，TGF-β1）及其下游细胞调节因子活性异常为主要特征［1］。因此，抑制HSC活化和减少肝组织内TGF-β1 的表达是逆转肝纤维化的中心环节。大黄虫丸（DHZCW）具有缓中补虚、活血化瘀、通络软坚等功效，以往的临床和实验研究表明该药在防治肝纤维化方面效果明显［2，3］。本实验拟观察大黄虫丸对CCl4 损伤大鼠肝组织内经旁分泌途径活化的星状细胞（HSC ）的增殖和TGF-β1 基因表达情况的影响，进一步探讨该药抗肝纤维化的作用机制。
       1  材料与仪器
       1.1  动物雄性Sprague Dawley（SD）大鼠，SPF 级，体质量400～500 g，均由中山大学中山医学院实验动物中心提供，普通饲料和普通饮水饲养。实验前禁食12 h。
       1.2  HSC 细胞株由北京大学人民医院肝胆外科中心魏玉华老师惠赠。
       1.3  药物大黄虫丸药粉为暗紫色粉末，由广东阳江制药厂惠赠。
       1.4  试剂和仪器链霉蛋白酶E（Pronase E）、Ⅳ型胶原酶（Type Ⅳcollagenase）、DNase I、胰蛋白酶（Trypsine）、Nycodenz 原液、噻唑蓝（MTT）均购自Sigma 公司；四氯化碳（CCl4）、高纯度琼脂糖、核酸染料等生化试剂购自上海生物工程有限公司；M199 培养液（标准型）、DMEM 干粉均购自Invitrogen 公司产品；标准胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自杭州四季青生物制品公司；总RNA提取试剂（RNAiso Reagent）、RT-PCR试剂盒（TaKaRa RNA PCR Kit (AMV) Ver. 3.0）及100 bp DNA Markers 均购自宝生物工程（大连）有限公司；引物由上海英骏生物技术有限公司合成；氚-胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）购自中国科学院上海原子核研究所等。OLYMPUS CX31 型倒置相差显微镜（OLYMPUS 公司）；Heraeus Biofuge 15R型台式高速冷冻离心机（德国Heraeus 公司）；Heraeus BB16 型CO2 恒温培养箱（德国Heraeus 公司）；SDJ-SP 三相单人水平层流洁净工作台（上海淀山湖净化厂）；FJ - 211G 双道液体闪烁仪（西安二六二厂产品）；Bio-Tek EL×800型全自动酶标仪（美国Bio-Tek 公司产品）；POWER-PAC300 型电泳仪（美国BIO-RAD 公司产品）；MJ PTC-100TM 型PCR 仪（美国MJ Rearch 公司产品）； BIO-MATE 5 型紫外可见光分光光度计（BIO-MATE 日本公司生产）等。
       2 方法
       2.1  含药血清及正常鼠血清的制备参考文献方法［4］给予SD 大鼠灌胃服用大黄虫丸药粉（每只每天2.7 g）。将上述药粉用超纯水溶解，每天分两次灌胃给药，4 ml/次，连续给药5 d。空白对照组为正常大鼠组，灌胃等量超纯水。采血时间为末次灌胃后1 h，以乙醚麻醉大鼠，无菌状态下打开大鼠心脏，经右心房抽血，2 000 r/min 离心15 min，血清经56℃灭活30 min 后置于-20℃冰箱内保存备用。
       2.2  造模采用SD 雄性大鼠，皮下注射50% CCl4 5 ml/kg （与植物油按1∶1比例混合），5 d 后分离KC。
       2.3  KC 的分离参考文献［5］ 并改进，分离培养损伤模型鼠和正常鼠的KC，台盼蓝染色法检测细胞活性，碳素墨汁吞噬实验鉴定细胞。正常大鼠的细胞得率为0.5×107～1.0×107 /肝，损伤模型鼠的细胞得率为1.0×107 ～1.5×107/肝,纯度均＞90%。
       2.4  HSC 细胞株的培养以5×103 cells/cm2接种于50 ml 培养瓶内，加入含10% FBS 的M199 培养液，每3 天左右铺满单层后传代。
       2.5  条件培养液（CM）制备①正常鼠KC 条件培养液（NKCCM）的制备：参考文献［6］ 并改进。KC 以1×105 cells/cm2 密度接种于6 孔培养板，培养48 h 后吸弃培养液，再加入含20% 正常鼠血清的DMEM 培养液3 ml 继续培养，24 h 后收集上清液，0.22 μm 微孔滤膜过滤，记为NKCCM。同样方法48 h 后再收集1次，两次的NKCCM 混合，置于-70 ℃冰箱中保存备用。②损伤鼠KC 条件培养液（KCCM）的制备：方法同上，但加入的血清为药物血清，浓度分别为含0% （0% 药物血清+ 20% 正常鼠血清），5% （5% 药物血清+ 15% 正常鼠血清），10% （10% 药物血清+ 10% 正常鼠血清）和20% （20% 药物血清，无正常鼠血清），收集的上清液分别记为0%，5%，10%和20% KCCM。
       2.6  实验分组①对照组：将HSC 细胞株接种于培养板培养24 h 后，弃去培养液，加入NKCCM，作用于HSC 24 h后即可检测。②旁分泌组：包括0%，5%，10%，20% KCCM组共4组。加入CM 方法同对照组。
       2.7  活化HSC 增殖的检测采用MTT 法和3H-TdR 掺入法检测。①MTT 法：称取125 mg MTT放入小烧杯中，加25 ml PBS（0.01 mol/L，pH 7.4）搅拌15 min，用0.22 μm 的微孔滤器除菌，分装后4 ℃避光保存备用。将铺满单层的HSC用0.25% 胰酶消化后，以103 cells /孔密度接种于96 孔板中。培养24 h 后，吸弃上清，分别加入NKCCM，0%，5%，10%，20% KCCM 各200 μl（每组设3 个复孔，用不同批次的CM 重复实验3 次）。继续培养至20 h后，每孔加入MTT 溶液（5 mg/m1）20 μl，孵育4 h弃上清液，PBS 洗涤，然后每孔加入200 μl DMSO，小心振荡10 min，使结晶物充分溶解。选择570 nm 波长，以酶标仪检测各孔OD 值。②3H-TdR 掺入法：将HSC以104 cells /孔密度接种于24 孔板中，培养24 h后吸弃培养液，再加入CM （方法同上），液体总量为500 μl/孔。培养至20 h 后，再每孔加入0.5 μCi/l00 μl 的3H-TdR，继续培养4 h 后吸弃上清，胰酶消化，洗涤，超速离心过滤后将细胞收集于玻璃纤维滤膜上，在60 ℃恒温干燥箱内放置30 min 烘干，移至测量管内，用液闪计数仪测定每孔HSC的放射活性即每分钟脉冲数值（cpm 值）。
       2.8  活化HSC 表达TGF-β1 mRNA 的检测采用半定量RT-PCR 两步法和琼脂糖凝胶电泳实验检测。以β-Actin 为内参照，以GenBank 库内TGF-β1 的最新mRNA 序列为准，同源比较后使用软件Primer Premier 5.0 设计引物并合成引物序列：TGF-β1 的上游引物为5"- CCGCAACAACGCAATCTATG-3"，下游引物为5"- AGCCCTGTATTCCGTCTCCTT -3"，产物片断长度为305 bp；参照文献［7］设计合成β-Actin 引物：上游引物为5"-GGCATCCTGACCCTGAAGTA-3"，下游引物为5"-GCCGATAGTGATGACCTGACC-3"，产物片断长度为565 bp。实验前将HSC以106 cells /孔密度接种于6 孔板中，培养24 h后吸弃培养液，加入CM（方法同上，液体总量为1.5 ml）。继续培养24 h 后吸弃CM，PBS 洗涤，加入RNAiso 试剂（1 ml/孔）充分裂解细胞。按试剂盒说明操作，提取细胞总RNA，紫外分光光度计测量吸光度值（OD 值）。提取的总RNA A260/A280 在1.6～1.8 之间，符合实验要求，而后进行逆转录反应。逆转录均采用随机引物（Olig dT），40 μl 体系，反应条件均为：42 ℃30 min，99 ℃ 5 min，5 ℃ 5 min，4 ℃保存。PCR 反应体系为25 μl （将试剂盒配量减半），上游和下游引物各加1 μl，内参照β-Actin 和目的基因不在同一反应管反应。β-Actin 的反应条件为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30 个循环，最后72 ℃继续延伸10 min，4 ℃保存；TGF-β1 的反应条件为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，34 个循环，最后72 ℃继续延伸10 min，4 ℃保存。取PCR 产物各5 μl加入1%琼脂糖凝胶上样孔，置于1×TAE 缓冲液内，80 V电压电泳40 min。取出凝胶块放入紫外分析仪数码相机照相记录结果，采用凝胶图像分析软件BandScan 5.0分析DNA 相对表达量，即目的基因TGF-β1 与内参照β-Actin 的总灰度比值，以相对比值代表基因的相对表达量。
       2.9  数据分析各组数据均使用±s表示，多组计量资料均数比较采用方差分析，组间两两比较采用SNK-q 检验。使用SPSS 13.0 统计分析软件分析数据，α=0.05。
       3  结果
       3.1  条件培养液对活化HSC 增殖的影响旁分泌组和正常对照组CM 对活化的HSC 作用24 h 后，MTT 法检测各组的OD值为：NKCCM （0.375±0.056）、0% KCCM （0.757±0.087）、5% KCCM （0.637±0.079）、10% KCCM （0.567±0.108）、20% KCCM （0.491±0.121）。由图1 可知，旁分泌组和正常对照组相比，OD值均升高，除20% KCCM 组与NKCCM 组间无明显差别外，其余组与NKCCM 组间的差别均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01，n=9），表明与正常鼠NKCCM 相比，损伤鼠的KCCM 对活化的HSC 有促增殖作用，但当达到20% 药物血清浓度时，活化的HSC 几乎恢复到正常鼠的静止状态。此外，旁分泌组的OD 值随着含药血清浓度的升高而出现明显下降，其中含药血清作用组（5% KCCM、10% KCCM、20% KCCM 组）和无药物血清作用组（0% KCCM 组）相比，差别有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01），表明含药血清作用后的KCCM 可以抑制活化的HSC 增殖，且呈一定的浓度依赖关系。
        旁分泌组和正常对照组CM 对活化的HSC 作用24 h 后，3H-TdR 试验结果显示各组的cpm 值为：NKCCM （296±156）、0% KCCM （795±105）、5% KCCM （579±138）、10% KCCM （381±124）、20% KCCM （308±135）。由图2 可知，旁分泌组和正常对照组相比，cpm 值均有升高，且旁分泌组中无含药血清组（0% KCCM 组）及含药血清组的5% KCCM 组和正常对照组间的差异显著（P＜0.01，n=9），而含药血清组（10%、20% KCCM组）和正常对照组间无明显差异（P＞0.05）；此外，旁分泌组组间比较，随着血药浓度升高，cpm 值逐渐降低，组间差别有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。其意义同MTT 法相同，且血药浓度达10% 时即已明显抑制HSC 的增殖。
       3.2  条件培养液对活化HSC 表达TGF-β1 基因的影响将各组条件培养液作用于活化的HSC 达24 h 后，各样本的PCR 产物电泳图如图3，对照组和旁分泌组的活化HSC 表达TGF-β1 mRNA 的相对量检测结果如图4 所示：NKCCM （2.316±0.181）、0% KCCM （2.625±0.185）、5% KCCM （2.576±0.123）、10% KCCM （2.487±0.144）、20% KCCM （2.405±0.157）。结果显示，旁分泌组与对照组比较，TGF-β1 基因的相对表达量均增加，差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01，n=9），表明TGF-β1 基因在早期的纤维化启动过程中就开始有表达。而旁分泌组中TGF-β1 基因的表达含药血清组均比无药物血清组明显降低（P＜0.05或P＜0.01），且随药物血清浓度的升高，降低越明显，说明TGF-β1 的表达可能与药物浓度存在依赖关系，进一步证实了DHZCW 药效与剂量间可能存在的关系。
       4  讨论
        肝损伤时，刺激HSC 活化的因素非常多，但涉及到细胞-细胞、间质-细胞间相互作用的途径不外两条，即旁分泌途径与自分泌途径。研究证实，HSC 是肝纤维化的细胞学基础，也是产生ECM 的主要细胞，而TGF-β1 则是促肝纤维化的关键细胞因子［1］。肝损伤炎症早期，肝KC 的旁分泌在启动HSC 活化中起着重要作用；后期，活化的HSC（此时又称为肌成纤维样母细胞，MFB）则分泌TGF-β、α 作用于自身，并促使未转化的HSC 向MFB 转化，合成ECM。即使肝损害因子已祛除，MFB 的自分泌和旁分泌仍可继续进行下去。因此，目前的临床和实验性抗肝纤维化治疗药物主要针对HSC （或MFB）、细胞因子（包括TGF、PDGF、CTGF 等）及其受体、活性氧自由基和胶原合成等。文献报道，正常肝KC 对HSC 并无激活作用，而损伤后KC 激活作用明显增加［8］。本实验也证实，同时加入不含药物血清的KC 条件培养液和正常鼠血清条件培养液后，前者的活化HSC 增殖明显，在加入不同浓度的DHZCW 药物血清后，则抑制了这种作用，且随着药物浓度的升高，抑制效应越强，呈现一定的药物浓度关系，反应了该药物可通过抑制旁分泌途径来抑制HSC 的进一步活化。
       
       目前已知TGF-β 存在5 种形式，哺乳动物体内主要存在TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3 种形式，并分别有各自相应的受体，在肝脏中含量最高且具有生物活性的是TGF-β1。TGF-β 以自分泌和旁分泌方式参与HSC 的活化［1，6］，促进HSC 合成各种胶原成分以及组织金属蛋白抑制剂（TIMPs），同时能够抑制基质金属蛋白酶（MMPs）的合成，引起ECM 积聚而导致肝纤维化的发生［9］。本实验结果显示，不含药的KCCM 加入后活化HSC 不仅增殖明显，TGF-β1 基因的表达也明显增加，当加入含药KCCM 后则抑制了活化的HSC 表达细胞因子TGF-β1。实验还表明，当药物浓度达到20%时，活化的HSC 有可能恢复到静止状态，TGF-β1 的表达却并未完全恢复，说明TGF-β1 不仅仅来源于HSC 的分泌，也可能来源于条件培养液。
       
       中医理论认为DHZCW 方中的大黄、桃仁可化血通瘀；地黄可养阴补血；白芍可养血柔肝，养阴清热；大黄等还可清热消炎；虫、水蛭类药则可走窜入络、活血软坚［10］。此外，大黄、地黄、甘草还可调节慢性肝炎及肝纤维化病人的免疫功能。研究表明，DHZCW 不仅可以改善肝炎肝硬化患者的临床症状和肝功能，还可以促进肝纤维化病变的修复。本实验从细胞和分子水平, 进一步验证了DHZCW 可通过抑制旁分泌途径以抑制活化HSC 增殖和细胞因子TGF-β1 的表达，达到抗肝纤维化的效应。
       【参考文献】
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