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       【摘要】 
       目的研究杜仲含药血清诱导骨髓间充质干细胞 (Mesenchymal stem cells,MSCs) 向成骨细胞定向分化过程的蛋白表达差异，分析杜仲诱导MSCs向成骨细胞分化的可能调控机制。方法对杜仲含药血清干预前、干预后第2天、第7天，第14天的细胞提取总蛋白，通过双向电泳分离、PDQuest-7.3.0胶图分析软件进行分析找出差异蛋白，并进行质谱分析、数据库查询建立功能蛋白质组。结果双向电泳分离得到641个蛋白点，选取其中75个点进行质谱分析，经数据库查询得到6个功能蛋白。结论实验认为补肾中药杜仲可能通过上调波形蛋白、核纤层蛋白A的表达促进细胞分化，下调钙网织蛋白表达，释放细胞内钙，参与钙结节的形成，与体内骨矿化过程有关。过氧化物歧化酶、膜联蛋白A6与细胞的活力有关，调节着细胞的分裂增殖与分化，但是否与定向成骨细胞分化有着密切关系尚有待进一步研究。
       【关键词】  杜仲　骨髓间充质干细胞　蛋白质组学　双向电泳
       Study on Proteome Change During the Process of MSCs Differentiation to Osteoblas Guiding by Blood Serum Containing Duzhong（Cortex Eucommiae）
       ZENG Jianchun, FAN Yueguang, LIU Jianren, YI Chunzhi, YAN Liang
       Guangzhou University of TCM, Guangzhou 510405， China
       Abstract:ObjectiveTo study the protein change in the process of MSCs differentiation to osteoblas guiding by blood serum containing Duzhong（Cortex Eucommiae）, and its  possible regulation mechanisms.MethodsTotal protein of cells interfered by blood serum containing Duzhong（Cortex Eucommiae）for 0day, 2days, 7days,14days, was extracted, runouted by two-dimensional electrophoresis and searched for different protein spot by PDQuest-7.3.0 software for analyzing gel picture.Functional proteome was established by mass chromatographic analysis and data base querying. Results641 protein spots were obtained, chose 75 spots to receive mass chromatographic analysis, and 6 functional protein were obtained by data base querying.ConclusionChinese drug Duzhong（Cortex Eucommiae）may up-regulate  express of  vimentin and lamin A to promote cell differentiation, down-regulate express of calreticulin to release intracellular Ca2+ which is related to Ca- nodus and bone mineralization in bodies. SOD and annexin A6 are concerned with corpuscular vigor, regulate corpuscular division growth and differentiation, but whether they have intimate relation with directional differentiation from MSCs to osteoblast is unknown, waiting for further research.
       Key words:Duzhong（Cortex Eucommiae）；  MSCs；  Proteome；  Two-dimensional electrophoresis
        骨髓间充质干细胞（MSCs）是一种多功能干细胞，在不同条件下可向成骨细胞、软骨细胞、心肌细胞等分化。中医学认为，肾藏精，主骨，生髓，经前期研究发现，杜仲含药血清能够诱导MSCs向成骨细胞分化并促进细胞增殖，但对于MSCs向成骨细胞分化这一复杂过程的机制缺乏相关研究。
       
       蛋白质组学研究是后基因组学时代又一重要研究工具，已经广泛应用到生命科学各个领域。本文建立补肾中药杜仲含药血清干预 MSCs体外定向分化为成骨细胞过程，采用蛋白组学技术分析MSCs分化过程中不同时间点蛋白表达的变化情况，从蛋白质分子水平上解释杜仲干预 MSCs分化的可能机理。
       1  器材
       1.1  动物SPF SD大鼠2只，体质量150～200 g，雌雄不限，由广州中医药大学实验动物中心提供。
       1.2  试剂L-DMEM培养基、南美洲胎牛血清（FBS、海克隆），杜仲（产地云南），0.25%胰酶（GIBCO公司），矿物油、标准蛋白、CHAPS、DTT、Indoacetamide（sigma），尿素（BBI），硫脲（天津市化学试剂一厂），PH3-10两性电解质（Bio-Rad），考马斯亮蓝 ( G2 250、R2 250 )、低熔点琼脂糖、苯甲基磺酰氟( PMSF)、三羟甲基胺基甲烷(Tris)、N,N"-甲叉双丙烯酰胺、甘氨酸、十二烷基磺酸钠 ( SDS)、溴酚蓝、甘油、无水碳酸钠、硫代硫酸钠、 三氟乙酸(TFA)、无水甲醇、无水乙醇、冰醋酸为国产分析纯，购于广州威佳公司。
       1.3  器材25，75，175 cm2培养瓶（Coning），酶标仪（Thermo），CO2培养箱 (Heraeus)，注射器针头滤器，0.22 μm滤膜（MILLIpore），SIGMA-3K15离心机（sigma），双向电泳仪器：Multiphor II（Amersham）、Protean II xi cell（Bio-Rad），IPG固相胶条（17cm，PH：3-10，Bio-Rad），PDQuest凝胶分析软件( 7.3.0版本) (美国Bio- Rad公司)、 Power look 2100XL凝胶图像扫描仪(美国UMAX公司)、质谱仪器4700 proteomics Analyzer（ABI公司），超低温冰箱（SANYO）。
       2  方法
       2.1  杜仲含药血清的制备取杜仲药材粗粉150 g，加70%乙醇10倍量，加热回流两次，1 h/次，过滤，合并滤液，滤液减压浓缩至300 ml，室温冷却，4℃冰箱保存备用。将中药药液稀释至0.3 g生药/ml灌胃，1 ml/次，2次/d，连续给药4 d，最后一次给药后1 h经腹主动脉采血，室温静置3 h后置4℃冰箱过夜，2 500 r/min离心20 min，收集上清液，针头滤器过滤除菌，置-20℃保存备用。
       2.2  MSCs 分离、纯化、扩增、诱导SD大鼠以10%水合氯醛0.7 ml经腹腔麻醉后，75%酒精浸泡颈部以下躯体5 min，无菌条件下取出双下肢股骨和胫骨，修洁软组织后，咬骨钳修剪骨端，暴露髓腔，10 ml注射器吸取含10%胎牛血清的L-DMEM培养基反复冲洗髓腔，至到骨质外观微微透亮。25 cm2培养瓶收集骨髓冲洗液，放37℃、5%CO2孵箱培养，每3天换液1次。当原代长满瓶底90%以上时0.25%胰酶消化后1∶1传代至75 cm2培养瓶，当细胞长满75 cm2培养瓶时，以0.25%胰酶消化后1∶2传代至长满4瓶75 cm2培养瓶，再以1∶1传代至175 cm2培养瓶，当细胞长满瓶底80%时其中3瓶加入含10%杜仲血清的L-DMEM，余下的一瓶细胞立即0.25%胰酶消化后收集细胞，并分别于诱导后第2天、第7天、第14天同法收集细胞，置-80℃保存备用。
       2.3  细胞总蛋白的提取及定量细胞解冻后用10 mmol/L Tris/250 mmol/L Srirose（pH 7.0）洗涤3次，加入2 ml裂解液〔8 mol/L 尿素，4%（W/V）CHAPS，65 mmol/L DTT，2%PHarmalyte-10〕混匀，加50 μg/ml RNase及200 μg/ml Dnase，在4℃放置15 min，再14 000 r/min，4℃离心30 min，上清bradford法测浓度，-80℃保存。
       2.4  第1向等电聚焦从冰箱中取出IPG预制胶条，用溶胀缓冲液（8 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，0.5％CHAPS,0.52%两性电解质，0.02％溴酚蓝，1％DTT）将胶条泡胀12 h。将胶条取出放入聚焦槽内，加入矿物油至没过上样杯，上样量为0.6 mg，并用溶胀buffer稀释至190 μl。对好正、负极，盖上盖子。设置等电聚焦程序（表1）。聚焦结束的胶条，立即进行平衡，第2向SDS-PAGE电泳。表1  等电聚焦程序（略）
       2.5  胶条平衡将胶条放入平衡缓冲液I（50 mmol/L Tris-HCl 6.8，6 mol/L尿素，30％甘油，2% SDS，2％ DTT，0.02％ 溴酚蓝）水平振荡15 min，再将胶条转入平衡缓冲液II（50 mmol/L Tris-HCl 6.8，6 mol/L 尿素，30％甘油，2% SDS，2.5％IAA，0.02％ 溴酚蓝）水平振荡15 min。
       2.6  第2向聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳胶条平衡之前配制丙烯酰胺凝胶4块，分离胶浓度为12%配制如表2。表2  聚丙烯酰胺凝胶的配置（略）
        第2次平衡结束后，将IPG胶条从样品水化盘中移出，放到已配好的SDS-PAGE凝胶上端，并将marker（分子量为97，66，45，30，20.1和14.4 kDa）放到凝胶的一端，再用0.5％的琼脂糖将胶条和marker封严，切忌不能产生气泡。并将胶板固定于电泳槽内。向电泳槽加入电泳缓冲液后，接通电源，100 V恒压电泳至溴酚蓝条带全部进入分离胶后调电压至120～150 V恒压电泳5～6 h，待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。电泳结束后，轻轻撬开两层玻璃，取出凝胶，进行染色。
       2.7  考马斯亮蓝染色将凝胶放入装有染色液（10％硫酸铵，10％磷酸，0.12％G250，20％甲醇）的水平盘内，并将水平盘置水平摇床上水平振荡过夜。收集染色液，将凝胶浸于脱色液（3％冰醋酸溶液）中，水平摇床振荡。最后换成MQ再洗涤30 min。
       2.8  图像分析及蛋白鉴定图像分析及蛋白鉴定：染色后的凝胶用水洗净后，采用扫描仪进行扫描成像，扫描分辨率设为300 dpi。考染图像分析采用PDQuest软件 (Bio-Rad)进行分析；分析过程包括点检测和编辑、建立和编辑比较组、比较组的数据分析及点的计数和解释等，具体方法参照软件操作说明进行。通过对分析胶的对比分析，可以找出比较组中表达呈现差异的蛋白点，这些差异蛋白点在考染凝胶中的对应蛋白斑点将作为质谱分析对象。
        对目标蛋白点进行胰蛋白酶酶切，提取多肽混合物。取0.3 μl肽段提取液，与等体积α-氰基- 4-羟基肉桂酸饱和的0.1TFA/50乙腈溶液混合后点于质谱仪的96孔不锈钢靶上。按照说明进行操作。
       3  结果
          
       经bradford法测定各组总蛋白浓度分别为0 d 3.24 μg/μl，2 d 4.10 μg/μl，7 d 4.7 μg/μl，14 d 7.27 μg/μl。说明杜仲含药血清能够促进细胞增殖。
        整个图谱来分析，点与点之间区分比较明显，可以对其进行蛋白质表达的差异分析。采用PDQuest-7.3.0胶图分析软件进行软件分析，找出差异蛋白点共641个，选取其中75个点行质谱分析并进行数据库查询。其中6个点具有积极意义。见图1～4。
        PDQuest-7.3.0胶图分析软件分析结果，各蛋白点表达量见表3。表3  各蛋白点表达量（略）
        对差异点进行MALDI-TOF分析，得到各自的肽质量图谱（见图5～10）。从图谱中可见，各肽质量指纹图谱信号较强，基线平稳，适合进一步数据库检索鉴定。
        根据得到各肽质量指纹图谱数据，及分子量范围和其他相关数据，通过NCBInr网站查询与之相匹配的蛋白，搜素结果见表4。表4  各点蛋白信息（略）
        F18为基质细胞衍生因子（SDF-1），本研究中发现随着杜仲含药血清对MCSs的诱导，SDF-1表达呈下调趋势，第14天时不能检测出，在杜仲含药血清诱导MSCs向成骨细胞诱导实验中发现，该时期MSCs已分化为成骨细胞，故不在表达SDF-1。说明基质细胞衍生因子表达于MCSs，而不表达于成骨细胞中，可作为检测MSCs分化程度的标志。
        骨髓间充质干细胞高度表达SDF-1可能是将骨髓间充质干细胞作为造血干细胞的基质细胞进行培养获得成功［1］的机制。骨髓造血干细胞与骨髓间充质干细胞均属于骨髓来源干细胞，骨髓间充质干细胞表达的SDF-1是第一个被发现能趋化CD+34细胞的细胞因子，体内外实验发现，CD+34造血干细胞可依据SDF-1的浓度迁移。有些报道SDF-1也具有刺激活性，增加造血干细胞的增殖分化［2］， 但是也有研究认为SDF-1仅具有趋化活性，SDF-1能刺激VEGF在造血中发挥作用［3］。
        目前在骨组织工程的种子细胞主要骨髓间充质干细胞和成骨细胞，而组织工程需要足够的细胞，由实验可以看出，以骨髓间充质干细胞作为种子细胞移植，可以比成骨细胞更多的聚集造血干细胞，造血干细胞具有分化为血细胞、血管内皮细胞的功能［4,5］，能改善局部缺血状态，更能达到组织工程的要求，如将两者作为共育体移植将对骨缺血坏死的治疗提供新的思路。
        G21是超氧化物歧化酶（SOD），属于金属酶，是一种主要的抗氧化酶，能清除超氧化物自由基，在防御氧的毒性、抑制老年疾病以及预防衰老等方面起着重要作用。实验中发现，随着MSCs向成骨细胞分化，该酶的表达逐渐减少，细胞出现衰老趋势或凋亡。MSCs作为原始细胞，具有很强的增殖能力和在条件诱导作用下分化的能力，高度表达SOD；而体细胞（成骨细胞）无再分化能力，随着MSCs向体细胞的分化，细胞活力呈现出逐渐下降的趋势，与SOD表达下调有着密切关系。E17为钙网织蛋白（CRT），是1974年命名的骨骼肌肌质网膜上的钙结合蛋白。结合钙的能力极强，参与钙的贮藏和信号转导；细胞黏附；基因表达的调控等。当细胞内钙网织蛋白含量下降时，钙从细胞中释放出，当细胞CRT过表达时，内质网Ca2+储量增多，［Ca2+］升高，SERCA拮抗剂thapsigargin诱导内质网Ca2+释放增多［6］；此时细胞对凋亡刺激的敏感性增强。实验中发现，随着MSCs向成骨细胞分化，钙网织蛋白表达量呈现出逐渐下调的趋势，当成骨诱导20天后，钙结节茜素红染色阳性，推测该蛋白与钙结节的形成有密切关系，在体内参与骨矿化过程。
         
       E4为波形蛋白(vimentin)，是间充质来源细胞的中间纤维蛋白，附在细胞核、内质网及线粒体的旁边或末端，因而相信波形蛋白在支撑及锚固原生质内的细胞器有着重要的角色。它亦能维持细胞的形状、细胞质的完整性及稳定细胞骨架内的相互作用。在试验诱导初期，骨髓间充质干细胞呈增生性变化，该蛋白表达量逐渐升高，后期向成骨细胞分化后，细胞增殖减慢，该表达量呈减低趋势。
         
       F6为核纤层蛋白A（lamin A），与波形蛋白同属于中间纤维蛋白的一种，是所有真核细胞核结构所必需的结构蛋白［7］，主要参与构成核的功能［8］，在核形成过程中起着重要作用［9］。两者与细胞分化有密切关系。在分化实验中，MSCs诱导前没有检测出该蛋白，表明此时MSCs尚处于增殖状态；当向MSCs的培养液中加入 杜仲含药血清后2 d后细胞开始表达该蛋白，表明MSCs开始分化。在杜仲含药血清干预过程中，呈现出逐渐上调的趋势，至第7天达高峰，14 d后逐渐下降。结果表明杜仲含药血清可以促进 MSCs 的分化过程。
       
       F3为膜联蛋白A6（annexin A6），膜联蛋白（annexins ）是一类结构相关钙依赖的磷脂结合蛋白超家族，约占细胞总蛋白的2％。在细胞中参与膜转运及膜表面一系列依赖于钙调蛋白的活动，包括囊泡运输、胞吐作用中的膜融合、信号传导和钙离子通道的形成、调控炎症反应、细胞分化和细胞骨架蛋白间的相互作用等。每种annexin蛋白在机体的不同组织和部位执行着不同的生物学功能，但是，每种annexin确切的生理功能尚不十分清楚。认为annexin I参与了膜的聚集、参与调控MAPK/ERK与cPLA2介导的信号传导、及在肿瘤细胞的增殖与分化、甚至细胞凋亡等生理过程中起重要作用。从本实验中发现，随着MSCs向成骨细胞分化，annexin A6的表达逐步升高，可以推断该蛋白可能具有促进细胞分化、抑制细胞增殖的作用。
       4  结论
        MSCs向成骨细胞分化是一个复杂的过程，其机制还不明确，实验认为杜仲可能通过上调波形蛋白、核纤层蛋白A的表达促进细胞分化，下调钙网织蛋白表达，释放细胞内钙，参与钙结节的形成，与体内骨矿化过程有关。过氧化物歧化酶、与膜联蛋白A6与细胞的活力有关，调节着细胞的分裂增殖与分化，但是否与定向成骨细胞分化有着密切关系尚有待进一步研究。
       
       骨髓间充质干细胞在早期高度表达的基质细胞衍生因子（SDF-1）是第一个被发现能趋化CD34+细胞的细胞因子，体内外实验发现，CD34+造血干细胞可依据SDF-1的浓度迁移。有些报道SDF-1也具有刺激活性，增加造血干细胞的增殖分化，但是也有研究认为SDF-1仅具有趋化活性，SDF-1能刺激VEGF在造血中发挥作用。造血干细胞表达CD34+，在CD34+参与下，HSC持续表达G蛋白耦联受体(G protein couplede receptors,GPCRs),CXCR4，cysLT1，S1P，S1P1等,促使细胞发生趋化、粘附从而引起HSC的迁移和聚集；证实骨髓间充质干细胞与造血干细胞有可能在同一培养条件下培养及共同移植。
       【参考文献】
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