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       【摘要】 
       目的研究甘松挥发油对大鼠心室肌细胞膜钠通道的影响，探讨甘松挥发油在离子通道水平抗心律失常的作用机制。方法用急性酶解法分离大鼠心室肌细胞，采用全细胞膜片钳记录技术，观察不同浓度的甘松挥发油对钠通道的影响。结果①浓度为1，3，5，10，20，100 μg /g甘松挥发油可浓度依赖性地抑制钠电流；②可使心肌细胞钠电流-电压曲线上移，但激活电位、峰电位及反转电位无改变；③使激活曲线向正电位方向变化，V1/2从(-43.65±0.98)mV右移至(-40.25±1.01)mV(n=6，P<0．05)；④使失活曲线向负电位方向变化, V1/2从(-100.92±0.68)mV左移至(-111.20±0.86)mV(n=6，P<0.05)。结论甘松挥发油可通过浓度依赖性地抑制大鼠心肌细胞膜钠通道电流，在不同膜电位水平对钠通道电流具有均匀一致的抑制作用；使激活曲线右移，使失活曲线左移。
       【关键词】  甘松　膜片钳　钠通道　心肌细胞
       Effects of Volatile Oil of Nardostachys chinensis on Sodium Channel in Isolated Ventricular Myocytes in Rats
       YANG Tao， GE Yuzhi， LUO Jun， HU Langji， ZHANG Shuhua， WU Zhiting
       Department of Cardiology,Jiangxi Provincial People"s Hospital,Nanchang,330006,China
       Abstract：ObjectiveTo observe the effects of the volatile oil of Nardostachys chinensis on sodium channel in isolated ventricular myocytes.MethodsSingle ventricular myocyte of rat was obtained by enzymatic dissociation method．The whole-cell patch clamp recording technique was used to record the change of sodium current by diferent dosages of the volatile oil of Nardostachys chinensis from 1 to 100 ppm.ResultsThe volatile oil of Nardostachys chinensis decreased sodium current in a dose-dependent manner. The current-voltage curve moved up while active potential，peak potential and reverse potential had no change．The activation curve moved to more positive potential and the inactivation curve moved to more negative potential．ConclusionThe volatile oil of Nardostachys chinensis could decrease sodium channel current in a dose-dependent manner,the activation curve is shifted towards the depolarizing direction and the inactivation curve is shifted towards the hyperpolarizing direction.
       Key words：Nardostachys chinensis；  Patch-clamp techniques；  Sodium channel；  Myocardium
        甘松为败酱科甘松属植物，具有抗心律失常作用［1，2］，甘松挥发油是甘松有效浓缩成分［3］，其抗心律失常的机制已有初步研究［4］。本研究应用膜片钳全细胞记录技术，观察甘松挥发油对大鼠心室肌细胞膜钠通道电流(INa)的影响，从离子通道水平探讨其作用机制。
       1  材料与仪器
       1.1  材料健康成年雌雄性大鼠，体质量250～300g，由南昌大学医学院动物所提供。甘松挥发油由江西省樟树市中医药研究所提供，用阴干后的甘松样品1 000 g，按《中国药典》Ⅰ部甲法进行水蒸馏，经6 h后停止加热，静置过夜，油水相分离后得浅绿色油状液体［5］。I型胶原酶(collagenase I)、HEPES(N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸)，CsC1(氯化铯)，谷氨酸，TEA-C1(氯化四乙胺)，Na2ATP，EGTA为Sigma公司产品。其它试剂均为国产分析纯。
       1.2  仪器膜片钳放大器(Axopatch 200B)及DigiData 1200B型数/模（或模/数）转换器均为美国Axon公司。   
       2  方法
       2.1  灌流过滤以5 U/g肝素钠对分离大鼠进行腹腔内注射，10～15 min后以1%戊巴比妥钠50 mg/kg腹腔内注射麻醉，迅速开胸取出心脏，放入4℃无钙液中，离体心脏修饰后经主动脉挂在Langendorf灌流仪逆行用无钙台氏液经主动脉逆行灌流5 min，通以100%纯氧。10 min后以浓度分别为0.6～0.7 g/L I型胶原酶，0.04～0.06 g/L蛋白酶E，0.3～0.5 g/L牛血清白蛋白（BSA）和50 μmol/L低钙酶液灌流心脏。30 min左右心脏松软后，改180～200 μmol/L低钙台氏液灌流心脏5 min，温度维持在36～37℃，灌流过程中始终予以氧气饱和，氧流量0.3～0.5 L/min。5 min后，将心脏从灌流装置上取下，剪除心房和乳头肌,留下心室肌组织块置于盛有KB液的烧杯中充分剪碎、轻轻吹打、100目尼龙网过滤，以去除可能影响离子流记录的组织碎片。过滤后置于KB液中室温下孵育1～2 h，然后置于4℃冰箱中保存。
       2.2   溶液配制无钙台氏液(mmol/L)：NaCl 136，KCl 5.4，MgCl2 1.0，NaH2PO4 0.33，HEPES 10，glucose 10，NaOH调pH至7．4。 KB液(mmol／L)：KC1 40，KH2PO4 20，MgSO4 3.0，KOH 80，谷氨酸50，牛磺酸20，HEPES 10，glucose 10，EGTA 0.5，KOH调pH至7.4。INa细胞外液(mmol/L)：氯化胆碱140，NaCl 15，MgCl2 1.0，CaCl2 0.5， HEPES 5，glucose 10，CsCl2 4.6，CoCl2 1.0，CsOH调pH至7.4。INa电极内液为(mmol/L)：CsCl2 120，NaCl2 10，MgCl2 1.0，Na2ATP 5.0，EGTA 10，HEPES 10，CsOH调pH至7.3。
       2.3  膜片钳全细胞记录方法选取纹理清晰、杆状和大小适中的细胞在室温下进行实验，将适量细胞加入体积约1．5 ml平放于倒置显微镜上的细胞池中，贴壁10 min后，用灌流法加药，流速约1.5 ml/min。在电极拉制仪分两部拉制电极，电阻1～2 MΩ。电极内灌以电极液，置于推进器上，通过三维操纵器驱动电极，并轻压在细胞表面，用负压使电极与细胞表面形成高阻封接后，补偿快电容并吸破细胞膜形成全细胞记录模式。调节慢电容补偿和串联电阻补偿80％～90％以减少瞬时充放电电流和钳位误差。信号经截止频率为1 kHz的四阶贝塞尔低通滤波器，采样率为10kHz。实验在室温(22～24℃)下进行。实验过程由pCLAMP 7.0软件程序(AXON，美国)控制，通过AD／DA转换板(AXON DigiData1200，美国)，进行刺激发放和信号采集，并存储于计算机硬盘中，供测量及分析用。为消除细胞间误差，电流值以电流密度(pA／pF)表示。
       2.4  统计学处理采用pCLAMP7.0软件对单个全细胞记录进行数据和图形转换，Origin7.0软件对数据进行曲线拟合及绘制浓度-剂量曲线，离子通道电流密度-电压曲线，电流密度(pA／pF)= 电流强度／电容；激活一失活关系曲线。所有数据以±s表示，用SPSS10.0统计软件做统计分析，采用配对样本t检验。
       3  结果
       3.1  钠通道电流的记录细胞内液用Cs+代替K+阻断钾电流。细胞外液用CoCl2阻断钙电流。细胞钳制电位（holding potential,HP）在-90 mV，施以钳制时间（clamp time, CT）60 ms的指令电位（command potential, CP）从-90 mV到+40 mV的序列除极方波，刺激频率为10 Hz，步长10 mV，诱发出具有电压依耐性内向钠电流（图1 A）。甘松挥发油5 μg/g作用5 min后可见内向电流明显减少（图1 B）。用细胞外液灌流冲洗后部分细胞能部分恢复被抑制的钠电流（图1 C）。这可进一步说明内向钠电流的减少是该药物引起的。
       3.2  甘松挥发油对钠通道电流作用的量效曲线细胞钳制电位（holding potential,HP）控制在-90 mV,用含不同浓度的甘松挥发油细胞外液灌流，观察1，3，5，10，20，100 μg /g对大鼠心室肌细胞钠电流的影响，其抑制率分别为（7.2±4）%，（20±3.7）%,（55±5）%,（76±3.5）%,（89±3）%，（100±0）%（每个浓度n=5，p<0.05）。用上述数据作图，然后采用I=ImaxCn/(Cn+EC50n)方程进行拟合，式中得到半数有效浓度EC50值为（4.95±0.61），斜率因子为（2.12±0.54）。见图2。
       3.3  INa电流-电压（I-V）曲线测定在电压钳模式下，从HP-90 mV逐步除极至+40 mV，阶跃+10 mV，维持时间40 ms，刺激频率0.5 Hz，以各激活电位下电流密度对相应电位作图得I-V曲线图，其中电流密度为各激活电位下电流与膜电容的比值，单位为皮安/皮法（pA/pF）。钳制电位为-90 mV，以5 μg /g甘松挥发油灌流液进行对照研究，可使电流-电压曲线明显上移。给药前后峰值电流从（-45.7±3.1）pA/pF减少至（-21.3±4.8）pA/pF(n=6，P＜ 0.01)。但不改变激活电位、峰电位、反转电位和曲线的形状。冲洗后部分细胞可以完全恢复，但对钠电流的激活电位、峰电位和翻转电位无明显影响。见图3。
       3.4  甘松挥发油对钠通道激活动力学影响为观察INa的激活动力学特征，将I-V曲线的结果转换成膜电导（G），对条件刺激电压作图，然后采用Boltzmann方程g/gmax=1-{1+exp［(Vm-Vl/2) /k］}-1进行拟合, 式中得到INa激活曲线，求得V1/2（半数激活电压）和S（斜率因子）。浓度为5 μg /g甘松挥发油使钠通道激活曲线V1/2从(-43.65±0.98)mV右移至(-40.25±1.01)mV(n=6，P<0.05)，S从(5.63±0.75)mV减少至(5.03 ±0.80)mV(n=6，P<0.05)。见图 4。
       3.5  甘松挥发油对钠通道失活动力学影响保持电位-90 mV，施于40 ms，阶跃为+10 mV，-150～+30 mV系列条件脉冲刺激，在每一条件脉冲后紧跟一固定除极至-30 mV，25ms的测试脉冲，然后回到-90 mV，记录钠通道失活电流。以电流相对值对条件脉冲电压作图，经Boltzmann方程进行拟合：I/Imax={1+exp［(Vm-Vl/2) /k］}-1，得INa失活曲线，然后求得Vl/2（半数失活电压）和S（斜率因子）。浓度为5 μg /g甘松挥发油使INa失活曲线Vl/2 从(-100.92±0.68)mV左移至(-111.20±0.86)mV(n=6，P<0．05)，S从(10.33±0.62)mV增加至(11.33±0.74)mV(n=6，P<0．05)见图 5。
       4  讨论
        INa是心肌细胞重要的跨膜离子通道电流，影响心肌细胞的兴奋和传导。钠通道主要参与动作电位的0相除极。钠通道的活性异常影响心肌的传导性和兴奋性，从而产生折返、异常自律性或触发活动，形成各种快速心律失常。INa异常会导致一系列的心律失常，尤其是心脏传导功能异常，促进了心律失常的发生［6］。一些抗心律失常药物就是通过阻滞钠离子通道后，抑制了心肌细胞的兴奋性和传导性，从而发挥抗心律失常作用。
       
       本试验采用全细胞膜片钳技术观察甘松挥发油对大鼠心室肌细胞INa的影响和钠通道动力学的改变。结果显示，在甘松挥发油浓度为（4.95±0.61）μg/g时可将INa抑制50%，且甘松挥发油浓度的增加对INa的抑制率也随之增加。甘松挥发油使I-V曲线上移但并不改变I-V曲线的激活电位、峰电位及反转电位，提示甘松挥发油在不同膜电位水平对INa具有均匀一致的抑制作用，说明甘松挥发油能降低动作电位幅度，减慢动作电位0相上升速度，对抗快速型心律失常。这也在一定程度上较好的解释了以甘松为主要成分的稳心颗粒能安全有效的治疗快速型心率失常［7］。本研究还发现，甘松挥发油使激活曲线右移，使失活曲线左移，提示甘松挥发油可减缓钠通道的激活过程同时可促进钠通道失活的过程。甘松挥发油除抑制INa的作用之外，我们的研究还显示具有抑制内向整流钾电流、L-型钙电流的作用（另文报道）。甘松挥发油对这些离子通道的综合作用，可能使心肌细胞的动作电位时程（APD）和有效不应期（ERP）适当延长，使得心肌兴奋性、不应性及传导性产生影响从而发挥抗心律失常的作用。
        由于甘松挥发油是一种挥发性物质，易于从吸入途径给药从而发挥作用。临床上多年来一般用口服和静脉给药抗心律失常，但是心律失常往往为阵发性的，而口服药物作用较慢，静脉给药又多在医院进行。国外统计数据显示，大部分心脏性猝死发生在医院外［8］。而挥发性的药物半衰期短，副作用小，携带方便，便于急救。所以甘松挥发油很有可能弥补这一块药物治疗的不足之处，故对甘松挥发油抗心律失常的研究有很大的临床价值。本研究的局限性在于：甘松挥发油对与其他心肌细胞膜离子通道的影响还有待进一步研究；甘松挥发油为一复合物，明确其真正发挥作用的单体成分是必要的。
       【参考文献】
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