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       【摘要】 
       目的探讨威灵仙类药材中多糖含量的差异。方法采用苯酚-硫酸比色法测定威灵仙类药材中多糖的含量;测定波长487 nm。结果威灵仙类药材中多糖含量有明显差异。结论应注意品种、生长环境等因素对药材质量的影响。
       【关键词】  威灵仙类药材　多糖　苯酚-硫酸比色法
       Comparison of the Contents of Polysaccharides in Medicinal Materias of Weilingxian
       WANG Xiangpei, HUANG Jie, JIN Fengyun, WU Hongmei,SUN Yichun，YANG Tao
       Guiyang College of Traditional Chinese Medicine,Guiyang 550002, China
       Abstract：ObjectiveTo compare the contents of polysaccharides in medicinal materias of Weilingxian.MethodsThe polysaccharides content of medicinal materias of Weilingxian was determined by Phenol-sulfuric acid colorimetry. The detection wavelength was 487 nm.Results There was apparent difference in polysaccharides content of medicinal materias of Weilingxian. ConclusionAttention must be paid to the effects of varieties and environment on the quality of medicinal materias.
       Key words：Medicinal materias of Weilingxian;   Polysaccharides;  Phenol-sulfuric acid colorimetry
       
       威灵仙为毛茛科植物威灵仙Clematis chinesis Osbeck.、棉团铁线莲Clematis hexapetala Pall.和东北铁线莲Clematis manshurica Rupr.的干燥根及根茎，具有祛风除湿、通络止痛之功效，主要用于治疗风湿痹痛，肢体麻木，筋脉拘挛，屈伸不利，骨哽咽喉等症状［1］，是古今中医临床常用的祛风湿止痛药。在贵州地区作商品威灵仙药材的品种繁多，除药典收载品种外，其中同科植物柱果铁线莲Clematis uncinata Champ.、山木通Clematis finetiana Levl的根及根茎为药材威灵仙的主要来源［2］。威灵仙含有多糖、皂苷等多种重要活性成分［3，4］。目前，已有威灵仙类药材中总皂苷及齐墩果酸含量的比较报道［2，5］。但比较具有抗氧化作用的威灵仙多糖含量的研究未见报道。因此，本文采用苯酚-硫酸比色法测定威灵仙类药材中多糖的含量并作比较和分析，以期为威灵仙类药材资源的合理开发利用提供参考。
       1 仪器与试药
        UV-2501型紫外可见分光光度计（日本岛津），80-2B离心机（湖南星科科学仪器），RE-52A 旋转蒸发仪（上海亚荣），循环水式真空泵（上海亚荣），数显恒温水浴锅（常州澳华），DZF-6020MBE型真空干燥箱（上海博讯实业），METTLER AB204-S型电子天平（美国梅特勒-托利多）。
        无水葡萄糖（天津科密欧，分析纯，批号20070807），乙醇，苯酚，浓硫酸，正丁醇，无水乙醇，丙酮，乙醚等试剂均为分析纯。柱果铁线莲Clematis uncinata Champ.根及根茎，威灵仙Clematis chinesis Osbeck根及根茎，山木通Clematis finetiana Levl. 根及根茎，均由贵阳中医学院王祥培副教授鉴定。
       2 方法与结果
       2.1 多糖的提取与精制称取已干燥的混合粉末（威灵仙、柱果铁线莲、山木通的粉末各30 g）90 g，置圆底烧瓶中，加入80%乙醇1 000 ml，90℃回流提取2 h，抽滤，滤渣挥干溶剂后，滤渣加15倍量蒸馏水，于沸水浴回流提取2 h，双层滤布过滤，残渣加15倍量蒸馏水，沸水浴重复提取1次，合并两次滤液，减压浓缩至200 ml，放冷，加入适量醋酸乙酯于50 ℃保温脱脂20 min，减压回收醋酸乙酯，用Sevage法除蛋白，反复进行8次至无蛋白层。除蛋白后的提取液加入终浓度为3%的过氧化氢，于50 ℃下保温脱色30 min。放冷后，加入乙醇至含醇量为85%，于4 ℃下静置过夜，再离心分离（3 000 r/min ，10 min），沉淀依次用无水乙醇、丙酮、乙醚各淋洗3次，60℃真空干燥至恒重，即得精制的混合多糖1.614 6 g(得率1. 79%)，密封保存备用。
       2.2  精制多糖的鉴别取混合多糖2 mg，用蒸馏水10 ml溶解后精密吸取1 ml至具塞试管中，加入1 ml α-萘酚溶液，混匀后沿试管壁加入浓硫酸溶液1 ml，静置观察。实验结果表明，液面交界处有混合多糖紫红色环状阳性反应。
       2.3  标准溶液的配制精密称取105 ℃干燥至恒重的葡萄糖15.57 mg，置100 ml容量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度，摇匀，制成0.155 7 mg/ml的标准溶液。
       2.4   5%苯酚溶液的配制 取苯酚100 g，加铝片0.1 g和碳酸氢钠0.05 g，常压蒸馏，收集182 ℃馏分。精密称取该馏分13.001 2 g，置于250  ml容量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度，摇匀后滤过至棕色试剂瓶中，放冰箱备用。
       2.5  测定波长的选择精密吸取0.155 7 mg/ml葡萄糖溶液和样品溶液各1.0 ml，置10 ml具塞试管中，加入5%苯酚溶液1.0 ml，混匀，迅速加入浓硫酸5.0 ml，摇匀后放置5 min，置60 ℃水浴中加热20 min，取出置冷水中冷却至室温，以相应的试剂为空白，在400～800 nm进行扫描，在487 nm有最大吸收。
       2.6  标准曲线的制作精密吸取上述标准品溶液0.05，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 ml于10 ml具塞试管中，分别用蒸馏水补至1.0 ml，摇匀。另取1.0 ml蒸馏水作空白对照。各管再加入1.0 ml的苯酚溶液，混匀，迅速加入浓H2SO4 5.0 ml，摇匀后放置5 min，置60 ℃水浴中加热20 min，取出置冷水中冷却至室温，于487 nm处测定吸光度。以吸光度为横坐标，葡萄糖浓度为纵坐标，绘制标准曲线，经过计算得回归方程：
        C=13.195A+0.180 5，r=0.999 9，葡萄糖量在7.785～62.28 μg范围内与吸光度呈良好的线性关系。
       2.7   换算因子的测定取60℃干燥至恒重的精制混合多糖约10 mg，精密称定，置100 ml容量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度，摇匀作贮备液。精密吸取贮备液0.5 ml用蒸馏水补至1.0 ml，摇匀。同标准曲线项下方法测定吸光度，由回归方程中求出3种药材的混合多糖溶液中葡萄糖浓度，按下式计算，测得平均换算因子f=1.677。
        换算因素f= W/(C·D)
        式中：W为混合多糖的重量(mg)；C为多糖贮备液中葡萄糖浓度(mg/ml)；D为多糖的稀释因素（ml）。
       2.8   样品溶液的制备取各药材粗粉约0.5 g（过40目筛）置三角烧瓶中，精密称定，加入40 ml 80%乙醇，90℃回流提取1 h，趁热过滤，药渣用80%热乙醇洗涤(10 ml×3)后，挥干溶剂。药渣连同滤纸置烧瓶中，加蒸馏水50 ml置沸水温浸提取1 h，趁热过滤，药渣用热水洗涤(10 ml×3)，洗液并入滤液中，置冷后，转移至100 ml容量瓶中，以蒸馏水定容至刻度，摇匀备用。
       2.9   精密度实验精密取柱果铁线莲样品溶液（贵阳三桥）0.7 ml，于10 ml具塞试管中，分别用蒸馏水补至1.0 ml，摇匀。按标准曲线项下方法操作，在487 nm处重复测定6次吸光度，计算，得RSD =0.61%，表明仪器精密度良好。
       2.10   稳定性实验准确吸取同一样品溶液0.7 ml于10 ml具塞试管中， 用蒸馏水补至1.0 ml，摇匀，按照标准曲线项下方法制备完成后1 h内测定吸光度(A)，每隔10 min测定1次，考察其稳定性。其RSD=1.47%，样品溶液在1 h内稳定。
       2.11   重复性实验取柱果铁线莲样品（贵阳三桥）约0.5 g，精密称定。按“2.8”项下方法操作，同时制备6份样品溶液。准确移取样品溶液0.7 ml，置于具塞试管中， 用蒸馏水补至1.0 ml，摇匀，按照标准曲线项下方法测定吸光度(A)，计算柱果铁线莲药材中多糖的平均含量为2.145%，其RSD =1.21%，表明含量测定方法的重复性良好。
       2.12  回收率实验精密称取0.25 g已知含量的柱果铁线莲药材粗粉（贵阳三桥）9份，均分成3组，分别加入4，5，6 ml的1.076 8 mg/ml精制混合多糖溶液，混匀后，按标准曲线项下方法测定含量，计算加样回收率。平均回收率为100.30%，RSD  =1.54%（n=9，已乘换算因素）。结果见表1。表1  加样回收率测定结果（略） 
       2.13  样品中多糖含量的测定精密吸取样品溶液适量，分别用蒸馏水补至1.0 ml，摇匀。按标准曲线项下方法测定吸光度，代入回归方程，计算样品中葡萄糖含量。按下式计算样品中多糖的含量。
        多糖含量(%)=C·D·f/W×100
       
       式中:C为供试液中葡萄糖浓度(mg/ml)；D为供试液的稀释因素；f为换算因素；W为供试品重量(mg)。结果见表2。表2  威灵仙类药材中多糖含量测定结果（略）
       3  讨论
        威灵仙多糖具有抗氧化的活性［3］，因此本文比较了黔产主要品种柱果铁线莲和山木通与药典威灵仙品种的多糖含量，实验结果显示威灵仙、柱果铁线莲、山木通中多糖的含量差异较大，其中山木通药材的多糖含量最高。同一品种的多糖含量差异也较大，可能是因为生长环境影响了多糖的含量。
        本文采用硫酸-苯酚法对威灵仙类药材中的多糖含量进行了测定，硫酸-苯酚法的测定原理为多糖类物质在硫酸的作用下，先水解成单糖分子，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后和苯酚合成为有色化合物，用比色法对其进行测定［6］。苯酚极易氧化，见光或空气即逐渐氧化变成淡红色，因此在使用前必须纯化苯酚，在测定中要避光和操作迅速，这样才能获得稳定可靠的结果。
        在样品液制备中，先用80％乙醇除去单糖、低聚糖和苷类等干扰成分，然后再用水提取多糖类成分。在加样回收试验中，采用加入威灵仙混合多糖的方法进行测定，这是目前同时测定多个品种中多糖含量的常用方法，如果加入标准物葡萄糖，则在制备样品时葡萄糖可能被80％乙醇溶解除去，会对实验结果带来很大影响。
       【参考文献】
         　　［1］国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］.北京:化学工业出版社，2005：175.
       
       ［2］王祥培，黄 婕，靳凤云，等.黔产威灵仙类药材的鉴定及总皂苷的比较［J］.华西药学杂志，2009，24（3）：293.
       
       ［3］陈彦，孙玉军，方 伟.威灵仙多糖的抗氧化活性研究［J］.中华中医药杂志，2008，23（3）：267.
       
       ［4］王亚,陈 彦,孙玉军.中药威灵仙研究概况［J］.中药材，2006，29（5）：513.
       
       ［5］黄婕，王祥培，靳凤云，等.贵州地区威灵仙类药材中齐墩果酸的含量比较［J］.中成药，2009，31（4）：619.
       
       ［6］王新,陆慧宁,林少琨.苦丁茶冬青叶多糖的提取及含量测定［J］.时珍国医国药,2006,17(10):1977.