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       【摘要】 
       目的建立HPLC-MS/MS测定小鼠肝、心、脾、肺、肾组织中氧化苦参碱和苦参碱浓度的方法。方法利用肝脏组织进行了提取方法的研究，考察了提取溶剂、提取温度、匀浆配比等对氧化苦参碱提取回收率的影响;测定以非那雄胺为内标,用电喷雾离子化和正离子多离子反应监测方式检测氧化苦参碱和苦参碱。结果组织-水为1∶10，在冰水浴中匀浆，以2%正丁醇氯仿混合溶剂的液-液萃取法处理样品;氧化苦参碱和苦参碱线性范围均为42 000 ng·ml-1;定量下限均为4 ng·ml-1;各组织方法回收率均在87.1%110.3%;批内、批间精密度<14%;提取回收率>58.6%。结论该含量测定方法准确、灵敏、简便、省时，适用于小鼠各脏组织中氧化苦参碱和苦参碱的含量测定。
       【关键词】  氧化苦参碱; 苦参碱; HPLC-MS/MS; 组织
       Determination of Oxymatrine and Matrine in Rat Tissue by HPLC-MS/MS
       CHEN Youjun1, LIU Yiming2, ZHAO Ruizhi2*, LIU Lijuan1
       (1.2006 Master of Guangzhou University of Chinese Medicine,Guangzhou 510120，China; 2.The Second Affiliated Clinical Hospital，Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou, 510006,China)
       Abstract：ObjectiveTo establish LC-MS/MS method for determination of oxymatrine and matrine in liver, heart, spleen, lung and kidney of rats.MethodsExtraction method was studied using rat liver, and the effect of solvent, temperature and the proportion of tissues-water on extraction efficacy of oxymatrine recoveries were investigated. Finasteride as an internal standard gas-auxiliary electrospray ionization source, oxymatrine and matrine were detected by the positive electrospray ionization (ESI)-MS method under multiple reaction monitor (MRM) mode. Results Tissues were homogenated in ice water bath with the tissue-water proportion of 1:10, extracted by 2% n-butanol and trichlormethane. The linearity of both oxymatrine and matrine ranged from 4 to 2000 ng·ml-1 ,the detection limits of them was 4ng·ml-1.The recovery of this method ranged from 87.1%110.3%.The values of RSD within day and between days were less than 14%. Mean recovery rates were more than 58.6%. ConclusionThis method is accurate，highly sensitive,simple and convenient, time saving for the simultaneous determination of oxymatrine and matrine concentrations in tissue of rats.
       Key words：Oxymatrine; Matrine; HPLC-MS/MS; Tissue
       氧化苦参碱(oxymatrine OMT)和苦参碱(matrine MT)是中药苦参中的主要活性成分，氧化苦参碱给药后，体内主要代谢为苦参碱[13]。两者均有抗肿瘤、抗菌、抗炎、抗风湿、抗病毒、抗寄生虫、抗心律失常等作用[4]。尽管关于氧化苦参碱与苦参碱分析方法的报道很多，但基本都是血液或体外样品含量测定，关于组织内两种成分同时测定还未见报道。组织成分复杂，有酶等多种生物活性物质存在，对氧化苦参碱有代谢作用，从而影响其含量测定，因此本文选择了药物主要代谢组织肝脏作为提取方法研究的对象，通过对提取溶剂、提取温度和匀浆配比等的考察，建立了稳定性好、专属性强、灵敏度高的HPLC-MS/MS同时测定小鼠脏器组织中氧化苦参碱和苦参碱含量的方法，对于氧化苦参碱体内分布及代谢研究等都有重要意义。
       1 材料与仪器
       1.1 动物广州中医药大学实验动物中心提供雄性KM小鼠[动物合格证号：SCXK (粤) 2003-0001]，体质量1822 g。
       1.2 试剂与药品氧化苦参碱(陕西一星生物制品有限公司);苦参碱(中国药品生物制品检定所，含量大于98%);非那雄胺(重庆万利康制药有限公司);氯仿、正丁醇(AR，天津市富宇精细化工有限公司);甲醇(HPLC 级，KYUNGKIDO公司 韩国);乙酸铵(HPLC级，Tedia公司，美国);纯化水为自制纯净水。
       1.3 仪器API3000型液相色谱-三级四极杆质谱联用仪：配有电喷雾离子源(ESI)，(AB公司，美国); 1100液相色谱系统，美国Agilent公司产品;超低温冰箱(NEW BRUNSWICK 英国);电子天平(BS224 S 北京赛多利斯仪器系统有限公司);IKA涡漩震荡仪(GENIUS 3)和IKA匀浆仪(T10)均为德国IKA制造;白洋台式离心机(G 20 河北省安新县白洋离心机厂);自制水浴空气吹干仪。
       2 方法
       2.1 色谱条件色谱柱为(Interlsil ODS-SP,5 μm，2.1 mm×150 mm);流动相为甲醇-10 mmol·L-1乙酸铵溶液(乙酸调pH值3.5)(80∶20);流速300 μl·min-1 ;柱温为室温;进样10μl。
       2.2 质谱条件电喷雾ESI源;喷雾电压IS为4 500 V;雾化温度450℃;雾化气NEB(GAS1)为12 L·min-1;加热辅助气AUX(GAS2)为6.5 L·min-1;帘气CUR为9 L·min-1;碰撞气CAD 6 L·min-1;检测方式为正离子多离子反应监测(MRM)，用于定量分析的母子离子对分别为氧化苦参碱(m/z265.3→247.2);苦参碱(m/z249.5→148.2)和内标物非那雄胺(m/z373.5→305.6)。见图13。
       2.3 标准品溶液及内标液的配制 精密称取氧化苦参碱和苦参碱适量，用水溶解并稀释成1 mg·ml-1的混合溶液作储备液;同法配制质控样品储备液;精密称取非那雄胺适量，用甲醇溶解并稀释成0.5 μg·ml-1溶液作内标液。
       2.4 组织样品采集将空白动物摘眼球采血后处死，立即取心、肺、肝、肾、脾等组织，用生理盐水洗去组织表面的残血，以滤纸拭干，置-80℃保存待处理。
       2.5 样品处理
       2.5.1 样品准备将肝组织室温下解冻后，称重，按组织-水(1∶4)加水匀浆，制备空白浆液待用。
       2.5.2 提取溶剂的选择取空白组织浆液配制成含氧化苦参碱、苦参碱及内标物适宜浓度的含药浆液，分4组，分别加入CHCl3、含2%正丁醇的CHCl3、乙醚、含20% NaOH 50 μl碱化的CHCl3各2 ml，每组3份，2 200 r/min涡漩震荡3 min，3 000 r/min离心5 min,取有机层，40℃空气吹干，测定，以各物质峰面积大小比较提取效果。结果含2%正丁醇的氯仿作为溶剂时氧化苦参碱、苦参碱及内标3种物质峰面积均较大，提取效果最好，因此以含2%正丁醇的氯仿作为提取溶剂。
       2.5.3 样品处理条件考察取空白肝匀浆液，配制成仅含氧化苦参碱500 ng·ml-1和非那雄胺100ng·ml-1的样品，分别按不同条件处理后(见表1)，加含2%正丁醇的CHCl3 2 ml,2 200 r/min涡旋震荡3 min，3 000 r/min离心5 min，取下层有机层40℃水浴中空气吹干，测定，以三者峰面积及氧化苦参碱和苦参碱峰面积比考察样品处理过程中的稳定性。结果见表 1。表1 样品处理条件考察表
       结果除冰水浴中处理组AMT为0，氧化苦参碱回收率较高，其它条件下都会出现苦参碱。在强酸碱条件下，苦参碱峰面积高达氧化苦参碱23倍多，加HClO4组，内标物质非那雄胺被破坏。故提取方法选择样品萃取前放置冰水浴中，取出后即加有机溶剂萃取。
       2.5.4 匀浆配比考察取空白肝组织分别按1∶4和1∶10加水匀浆，配制成一定浓度的氧化苦参碱和苦参碱样品，取200 μl处理，每个比例组各5份，结果1∶10匀浆组重现性符合要求，而1:4匀浆组则重现性较差。
       因此样品处理方法为：组织按1∶10加水，置0℃匀浆，取浆液200 μl，加0.5 μg·ml-1内标物非那雄胺甲醇溶液50 μl混合均匀，以含2%正丁醇的氯仿2 ml 2 200 r/min涡漩振荡3min，3 000 r/min离心5 min，取下层有机相40℃空气吹干，得残渣待测。其它组织处理同肝脏。
       2.6 样品测定 将挥干溶剂后的残渣用流动相200 μl 2 000 r/min涡漩30s，0.2μm滤膜离心滤过，取滤液进样10 μl测定，记录结果。
       3 结果
       3.1 方法专属性在选定条件下，肝组织中氧化苦参碱和苦参碱的保留时间均约为1.33 min，内标物非那雄胺保留时间约为2.7 min，其中内源性物质不干扰两者的测定。色谱图见图4。
       3.2 标准曲线及线性范围取0℃空白组织浆，加入氧化苦参碱和苦参碱混合准品溶液配制成浓度为4，10，50，100，500，1 000，1 500，2 000 ng·ml-1的标准品组织浆液，按“2.5”项下方法处理样品，以氧化苦参碱和苦参碱的峰面积与内标物峰面积之比(Y)为纵坐标，对它们的浓度(X)进行回归分析(权重1/x2)，得各组织氧化苦参碱和苦参碱浓度在42 000 ng·ml-1线性关系良好，定量下限均为4 ng·ml-1，各组织回归方程及相关系数。见表2。表2 各组织标准曲线及相关系数
       3.3 精密度与准确度取0℃空白组织浆液加入氧化苦参碱和苦参碱标准品混合溶液适量，配制成8，200和2 000 ng·ml-1的低、中、高浓度质控样品，各浓度5份样品按“2.5”项下方法操作，测定，日内进样，求算日内精密度;此法重复测定3 d，求日间精密度，结果见表3;将实测值与真实值相比得方法回收率表示准确度。结果见表4。
       3.4 提取回收率取8，200，2 000 ng·ml-1的低、中、高3个浓度的质控样品各5份，按“2.5项下方法”操作，以提取后各浓度氧化苦参碱和苦参碱的色谱峰面积与空白组织提取后加入同浓度标准品流动相溶液后进样获得的峰面积之比，考察方法的提取回收率，分别计算低、中、高3种浓度的提取回收率。结果均大于58%。
       3.5 稳定性本试验条件下，各组织样品中氧化苦参碱和苦参碱经3次反复冻融和-80℃保存60 d，保持稳定;样品置冰水浴中放置6h保持稳定;处理后样品供试液室温放置至少6 h后，保持稳定。表3 各组织中氧化苦参碱和苦参碱精密度结果表4 各组织中氧化苦参碱和苦参碱准确度结果
       4 讨论
       在组织样品处理中，我们发现氧化苦参碱在组织中提取率较低，而且随样品放置时间延长有不断降低的趋势，但苦参碱提取率则相应增加，均大于100%，且随放置时间延长升高。可知室温下氧化苦参碱在组织中存在转化成苦参碱的现象，转化随放置时间延长而增多，因此本实验在样品处理过程中对氧化苦参碱的稳定性作了重点考察。我们从破坏酶活性及温度对转化的影响等因素出发，用酸、碱和HClO4沉淀蛋白以及不同温度等进行了考察。结果在H2SO4和NaOH处理后，并不能抑制其转化，其中前者处理转化还显著增加。HClO4处理后也不能抑制转化，且内标物非那雄胺可能在强氧化剂下被破坏而测得的峰面积极小。在不同温度条件考察中，转化随温度升高而增加，加入H2SO4后转化增加可能与其放热导致温度升有关，其中70℃蛋白变性的情况下，几乎全部转化成苦参碱，但在0℃放置1 h，以及之后在冰水浴中放置6h的稳定性实验显示其基本保持稳定。因此我们选择在低温条件下(置冰水浴中)配制标准品，置冰水浴中解冻含药样品，样品取出后即用有机溶剂萃取的方法进行样品处理。
       本实验所建立的HPLC-MS/MS方法可同时测定组织中氧化苦参碱与苦参碱含量，回收率，精密度等均符合生物样品测定要求，氧化苦参碱与苦参碱定量范围为42000ng·ml-1，灵敏度高，重现性和专属性好，操作简单，测定迅速，为3.2 min。故本法适用于氧化苦参碱及其主要代谢物苦参碱的组织药物浓度测定，尤其对于大批量生物样品的测定可以节省时间，提高效率。
       【参考文献】
         　[1] 陈 勇，陈怀侠，杜 鹏，等.LC/MS分析大鼠体内氧化苦参碱及其主要代谢物[J].药学学报，2005，40(8)：740.
       
       [2] 王明雷，周秋丽，王本祥.氧化苦参碱肠内菌代谢及吸收入血活性成分的研究[J].中国中药杂志，2001，26(4)：272.
       
       [3] 王素军，王广基，李晓天，等.LC—MS法研究血浆中氧化苦参碱及其代谢物在犬体内的药代学[J].中国中药杂志，2005，30(2)：133.
       
       [4] 蒋合众.苦参碱及氧化苦参碱药理作用和制备方法研究进展[J].实用中西医结合临床，2007，7(l)：89.