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       【摘要】 
       目的优选金花茶种子中总多酚的提取工艺。方法采用丙酮-水法从金花茶种子中提取总多酚，利用正交实验优选总多酚最佳提取工艺，考察丙酮浓度、时间、温度、提取次数及料液比对总多酚收率的影响。结果总多酚的最佳提取工艺为：25倍量的50%丙酮-水，80℃，提取3次，4 h/次，总多酚含量为9.59%，总多酚的收率为1.71%。结论丙酮-水提取法可用于金花茶种子中总多酚的提取，其中提取溶剂倍量和提取温度对总多酚提取的影响较大。
       【关键词】  金花茶种子; 总多酚; 提取工艺; 正交实验
       Optimum Technology for Extraction of Total Polyphenol from Theopsis Chrysantha Hu.Seeds by Orthogonal Test
       TANG Qian1, LUO Yanying2, TANG Ling1,HUANG Liandong2,YU Dayong1, FENG Baomin1, WANG Yongqi1*
       (1.Institute of Materia Medica of Dalian University, Dalian,Liaoning 116622,China;2.Park of Jin Hua Cha of Nanning,Nanning,Guangxi 530022,China)
       Abstract：ObjectiveTo optimize the technology for extraction of total polyphenol from Theopsis chrysantha Hu. Seeds.MethodsThe seeds was extracted using acetone-aqueous, and the extract rate of total polyphenol was studied by orthogonal test, and the effects of solvent concentration of extraction, time of extraction, temperature of extraction, number times of extraction, solvent times of extraction were investigated.ResultsThe optimum extraction technology was as follows: 25 times 50% acetone-aqueous, extracting 3 times at 80℃ for 4h once. By this technology the extraction rate of total polyphenol was 1.71% and the content of total polyphenol was 9.59%. ConclusionThis method can be applied the extraction of total polyphenol in Theopsis chrysantha Hu. Seeds. The extracting solvent times and temperature of extraction show objective effects.
       Key words：Theopsis chrysantha Hu.seeds; Total polyphenol; Extracting technology; Orthogonal test
       金花茶Theopsis chrysantha Hu是山茶科山茶属金花茶组植物, 有32个种5个变种。金花茶在我国仅分布于广西的南部和西南部。广西成为目前已知的金花茶现代分布中心，被誉为金花茶的故乡[1] 。
       金花茶种子中所含多元酚类化合物,主要包括儿茶素类物质、黄酮类和没食子酸等。多酚类物质是一类具有独特生理活性和药理活性的天然产物,在抗诱变、抗肿瘤、抗病毒、抗微生物、抗衰老、抗氧化等很多方面具有良好的作用[2,3] 。
       我们前期的研究表明，金花茶种子中的多酚类成分具有抗激素依赖性肿瘤的作用，如：乳腺癌、前列腺癌、宫颈癌等。故在单因素研究的基础上，以金花茶种子中总多酚收率为指标，利用正交实验优选了总多酚的提取工艺。现报道如下。
       1 仪器与试药
       1.1 仪器unico 7200可见分光光度计(尤尼柯上海仪器有限公司);Laborata4000型旋转蒸发仪(Heidolph公司);BP210S十万分之一电子天平(Sartorius公司);水浴锅HH-4(国华电器有限公司);真空干燥箱DZF-6021型(上海精宏实验设备有限公司);循环水式真空泵SHZ-D(巩义市英峪圣华仪器厂)。
       1.2 试药 金花茶种子Theopsis chrysantha Hu.Seeds于2008-10月采集于广西省南宁市金花茶公园，鉴定人：广西林业科学研究院高级工程师梁盛业;对照品(没食子酸 中国药品生物制品检定所，批号：120563-200412，纯度99.1%)，其余试剂均为分析纯。
       2 方法和结果
       2.1 总多酚的测定[4]
       2.1.1 标准曲线的绘制精确称取干燥至恒重的没食子酸对照品10 mg , 置100 ml棕色容量瓶中, 加水溶解并稀释到刻度, 摇匀, 精密量取25 ml, 置100 ml棕色容量瓶中,用水稀释至刻度, 摇匀, 得浓度为0.025 mg· ml- 1 的对照品溶液;精确吸取没食子酸标准溶液0，0.5 ，1.0 ，1.5 ，2.0 和2.5 ml分别置10 ml棕色容量瓶中, 各加水至5 ml, 再分别加入磷钼钨酸试液1 ml, 用29% Na2CO3 溶液稀释至刻度, 摇匀, 以相应的试剂为空白, 30 min 后, 在754 nm 波长下测定吸光度A 。以吸光度A 为纵坐标, 体积V(ml) 为横坐标, 绘制标准曲线。得到回归方程A=0.353 2V-0.029 2(R2=0.999 1)。
       2.1.2 样品溶液的测定准确称取10.0 g金花茶种子，粉碎，与500 ml的圆底烧瓶中，按实验设置的处理条件提取，回收溶剂后真空干燥，准确称取干燥粉末50 mg用水溶解，定溶至50 ml的容量瓶中，摇匀，精密量取5ml置于25 ml的棕色容量瓶中，摇匀，准确取2 ml于棕色容量瓶中，照“2.1.1”项下自“各加水”后同法测定吸光度，带入回归方程中计算总多酚的含量，并计算总多酚的收率。总多酚收率(%)=提取液中总多酚质量/金花茶种子质量×100%。
       2.2 单因素实验[5，6]
       2.2.1 提取溶剂的浓度对总多酚收率的影响在恒定浸提时间为3h、浸提温度为100℃、提取次数为1次、料液比为1∶15的条件下，分设40%，50%，60%，70%共4个提取浓度进行提取，计算金花茶种子中总多酚的收率。结果如图1所示，随着丙酮浓度的增加，总多酚的收率增加，当丙酮浓度为55%时总多酚的收率最高，但随着丙酮浓度的继续增加，总多酚的收率明显降低，可能是由于55%丙酮水溶液对总多酚溶解性能好﹑对原料的溶胀系数高的原因。故选提取溶剂为55%丙酮-水。
       2.2.2 料液比对总多酚收率的影响在恒定浸提时间为3h、浸提温度为100℃、浸提次数为1次、提取溶剂为55%丙酮-水的条件下，分设1∶10，1∶15，1∶20，1∶25 (W/V) 共4 个溶剂倍量进行提取，计算总多酚的收率，结果如图2。由图2可知，总多酚的收率在料液比为1∶20时达到最高点，故选定料液比为1∶20。
       2.2.3 提取温度对总多酚收率的影响在恒定提取时间为3 h，提取次数为1次、料液比为1∶20、提取溶剂为55%丙酮-水的条件下，分设50，60，70，80，90，100℃,6个温度点进行提取，计算总多酚的收率，结果如图3。由图3可知，总多酚收率随提取温度的升高而增大，但温度高于75℃，总多酚含量明显下降。因此，选定75℃为最佳提取温度。
       2.2.4 提取时间对总多酚收率的影响在恒定浸提温度为75℃、提取次数为1次、料液比为1∶20、提取溶剂为55%丙酮-水的条件下，分设1，2，3，3.5，4，5 h,共6个提取时间，计算总多酚的收率。从图4可以看出，提取时间为3.5h的时候总多酚收率最高，随着提取时间的延长，总多酚的收率基本不变，故选定3.5 h为最佳提取时间。
       图4 提取时间对总多酚收率的影响
       2.2.5 浸提次数对总多酚收率的影响在恒定浸提时间为3.5 h、浸提温度为75℃、料液比为1∶20、提取溶剂为55%丙酮-水的条件下，分设1次，2次，3次，4次,共4个提取次数进行提取，计算总多酚的收率，结果见图5。由图5可知，提取3次即可将总多酚提取完全。故设定提取次数为3次。
       图5 浸提次数对总多酚收率的影响
       2.3 正交实验考察采用L9(34)正交表考察最佳工艺条件。多酚含量测定及总多酚收率计算同“2.1.2”项。正交实验因素水平安排见表1，实验结果见表2。表1 因素水平
       3 结论
       分析可知，各因素的影响依次为D=C>A>B, 即提取溶剂倍量=提取温度>提取溶剂浓度>提取时间,所以最佳工艺组合为A1B3C3D3，即25倍量的50%丙酮-水，80℃，提取3次，4 h/次，总多酚含量为9.59%，总多酚的收率为1.71%。其中提取溶剂倍量和提取温度对总多酚提取的影响较大。
       【参考文献】
         　[1] 梁盛业,陆敏珠,黄连冬，等.中国金花茶栽培与开发利用[M].北京：中国林业出版社，2005：3.
       
       [2] Khan N, Mukhtar H.Tea polyphenols for health promtion[J].L ife Sciences, 2007, 81 (7) : 519.
       
       [3] Chandra Mohan K V P, Gunasekaran P, Varalakshmi E,et al.In vitro evaluation of the anticancer effect of lacto-ferrin and tea polyphenol combination on oral carcinoma cells[J].Cell Biology International, 2007, 31 (6) : 599.
       
       [4] 国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部[S].北京：化学工业出版社，2005：附录57.
       
       [5] 陈红惠，吕 静，彭 郦，等.雪莲果叶中多酚的提取工艺研究[J].食品科学,2009, 30 (2):88.
       
       [6] 颜栋美,李仁菊,丘 华，等.金花茶多酚提取工艺的研究[J].现代食品科技，2007,23(9)：45.