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       【摘要】 
       目的观察、探讨自体外周血单个核细胞(PBMC)对原代肝癌细胞生长的影响及芦荟多糖AP11的干预作用。方法以手术切除肝癌组织为标本，胰酶短暂消化加吹打、单细胞悬液培养法原代培养肝癌细胞。通过倒置显微镜观察其形态学特征。于分离培养第2天，加芦荟多糖AP11、芦荟多糖AP11干预及未干预的PBMC于癌细胞中，倒置显微镜观察其对癌细胞形态的影响，MTT法观察其对癌细胞生长的影响。结果采用胰酶短暂消化加吹打分离、单细胞悬液原代培养的方法，可成功获取原代肝癌细胞;与空白对照组相比，芦荟多糖组癌细胞在形态上无明显差别，MTT实验结果表明其对癌细胞的生长无明显影响;与空白对照组相比，芦荟多糖AP11干预与未干预PBMC组癌细胞形态均有较大变化，MTT实验结果表明，其对癌细胞的生长有显著抑制作用。结论芦荟多糖AP11无直接体外抗肿瘤活性，其抗肿瘤活性可能是通过与PBMC的相互作用，通过调节机体的免疫系统而达到的。
       【关键词】  外周血单个核细胞; 原代肝癌细胞; 细胞模型; 芦荟多糖; 抗肿瘤活性
       Effect of PBMC on Homebody Primary Hepatoma Cells and the Intervention of Aloe vera Polysaccharide
       MIAO Yanyan1, HUANG Zhaosheng2*, WEI Jianan3, WU Lirong2
       (1.Post-doctoral Mobile Research Center of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou,Guangdong 510405,China;2. Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou,Guangdong 510405,China;3.Central Laboratory of Guangdong Hospital of TCM, Guangzhou，Guangdong 510000,China)
       Abstract:ObjectiveTo observe the effect of PBMC on homebody primary hepatoma cells and the intervention of Aloe vera polysaccharide.MethodsWith hepatoma tissue as sample, primary culture hepatoma cells were isolated by using the method of pancreatic enzyme transient digestion and simultaneous blowing, and its morphology was observed by inverted microscope. Then AP, PBMC and PBMC dealt with AP were added to primary culture hepatoma cells after two-day cultivation, and the effect on carcinoma cell morphology was observed. The effect on the carcinoma cell growth was measured by MTT assay. ResultsPrimary culture hepatoma cells were successfully isolated from hepatoma tissue by using the method of pancreatic enzyme transient digestion, simultaneous blowing and monocellular suspension. Compared with the control group, AP group had no obvious effect on primary culture hepatoma cells, but the PBMC and interfered PBMC group had significant effect on primary culture hepatoma cells. Some cells became fusiform from polygon, and some became shrinking, dark and round. MTT assay indicated that, compared with the control group, AP11 had no obvious effect on primary culture hepatoma cells(P>0.05), but PBMC and interfered PBMC significantly inhibited the hepatoma cell growth(P<0.01). Conclusion AP11 has no direct antineoplastic activity, and its antineoplastic activity maybe contribute to the interaction with PBMC and regulate immunologic system.
       Key words:Peripheral blood mononuclear cell(PBMC); Primary hepatic carcinoma cell; Cell model; Aloe vera polysaccharide; Antineoplastic activity
       目前，肿瘤细胞株常作为体外筛选具有抗肿瘤药理活性药物的实验模型。但由于体外培养时间长、传代次数过多，肿瘤细胞的生物学特性不免发生了某些变化，不能更真实地反映体内肿瘤细胞的生长特性。而利用患者外周血中的单核细胞进行体外培养、扩增，然后回输体内，激活患者的免疫系统，进而杀灭、限制肿瘤细胞的方法，近年来在临床上有了一定应用，并取得了较好效果。本研究原代培养了自体外周血单个核细胞(PBMC)及肝脏肿瘤组织癌细胞(PHCC)，观察了自体PBMC对PHCC生长、形态的影响及芦荟多糖的干预作用。以原代细胞为模型，初步验证了芦荟多糖及其干预的PBMC对HepG2生长及形态的影响。
       1 材料与仪器
       1.1 药物与试剂芦荟多糖AP11，由本实验室提取;Hank’s液、培养基RPMI1640、胰蛋白酶、台盼蓝，均由广州威佳科技有限公司提供;胎牛血清，Gibico公司提供;四唑氮蓝、二甲基亚砜，由美国Sigma公司提供;人淋巴细胞分离液(LTS1077)，天津灏洋生物制品科技有限责任公司提供。
       1.2 仪器YXQ-LS-505II立氏压力灭菌器，上海博讯实业有限公司生产;YHG-X远外快捷恒温干燥箱、H.H.S11-2型电热恒温水浴锅，上海医疗器械厂生产;TDL-40B台式离心机，上海安亭科学仪器厂生产;SW-CJ-1F超净工作台，上海圣欣科学仪器设备厂生产;二氧化碳培养箱，美国Biorad公司生产;BS110S电子分析天平，德国Sartorius公司生产;IMT-2B型倒置显微镜，日本Olymplus公司生产;L11 Nikon数码照像机，日本尼康公司生产。
       1.3 其它人体新鲜外周静脉血、肝癌组织，由肝癌患者提供(原发性肝细胞肝癌，分化较差，临床分期Ⅱ期)。
       2 方法
       2.1 人PBMC分离制备在肝癌患者手术前3天采取其外周静脉血6 ml，以人淋巴细胞分离液梯度离心分离。
       2.2 原发性肝细胞癌癌细胞的制备[1，2]
       2.2.1 取材手术室中无菌采取新鲜原发性肝癌癌组织后置入含青霉素(100 U/ml)、链霉素(100 μg/ml)的RPMI1640培养基内，冰盒保存，并于2 h内处理。
       2.2.2 初步处理切下未坏死的肝癌组织置小烧杯中，以适量Hanks液清洗23次，去掉组织块表面血污。置培养皿中，加入Hanks液，用眼科剪除去血块、坏死组织和结缔组织，再用Hanks液漂洗两次后，剪成约1 mm×1 mm×1 mm小块。
       2.2.3 原代肝癌细胞分离及分组培养将组织小块置于另一培养皿中，加入适量含青霉素(100 U/ml)、链霉素(100 μg/ml)的RPMI1640培养基内，用5 ml一次性注射器的活柄将其轻轻压碎，加入0.25%的胰蛋白酶和EDTA，消化12min后加入等量含血清培养液停止消化，用吸管吹打数次，过120目尼龙网，收集滤液，1 000 r/min离心10 min，弃上清，加PBS悬浮洗涤细胞，1 000 r/min离心10 min，弃上清，用含20%的FBS RPMI1640培养液12 ml重新悬浮成单细胞悬液。混匀后平均接种于6孔板中，置于37℃，5%CO2浓度的二氧化碳培养箱内培养，20 min后，轻轻晃动培养皿，小心吸出上清，混匀，分置另一培养皿中培养。再过30 min，同样方法吸取上清，混匀，分别种于另一培养皿中，共4孔，每孔2 ml，另取其中2 ml种于96孔板中，共16孔，分为4组，每孔100 μl细胞悬液，37℃，5% CO2浓度的二氧化碳培养箱内培养，适时观察。
       2.2.4 芦荟多糖对原代培养肝癌细胞形态的影响培养12 h后，小心更换培养基，倒置显微镜下观察细胞形态变化及贴壁情况。并于分离培养24 h后，于6孔板中分别加入芦荟多糖AP11(200 μg/ml)，未干预PBMC(1×105/孔)，多糖干预PBMC(1×105/孔)，空白对照孔加入等体积完全培养基，定时观察细胞生长情况。
       2.2.5 同源PBMC对肝癌细胞生长的影响原代肝癌细胞分离培养24 h后，于96孔板中分别加入多糖AP11(200 μg/ml)，多糖干预PBMC(体外多糖AP11干预培养3 d，细胞浓度：1×104/孔)和未干预PBMC(体外培养3 d，细胞浓度：1×104/孔)，空白对照孔加入等体积完全培养基，定容至200 μl，共同培养24 h后，去上清，加PBS洗板2次，加MTT 100 μl(浓度：0.5 mg/ml)，继续培养4 h，去上清，加DMSO，振荡混匀，酶标仪检测A570值。
       2.3 统计学方法采用SPSS11.0统计软件，组间比较采用单因素方差分析。方差齐采用LSD检验，方差不齐采用Tamhane"s T2检验，数据以±s表示。
       3 结果
       3.1 肝癌细胞的原代培养胰酶短暂消化加吹打分离、单细胞悬液培养的方法，可成功获取原代肝癌细胞。培养6h后即可在倒置显微镜下观察到贴壁细胞，48 h可观察到细胞呈单个或团块状贴壁生长，每个团块约有20100个不等的细胞，有的细胞已经完全贴壁展开(见图12)。
       3.2 原代肝癌细胞形态学研究倒置显微镜下，活细胞以多边形或不规则上皮样细胞为主，有少量梭形细胞(见图34)。细胞核异型性明显，核仁清晰，核大，胞质少，胞浆内可见丰富颗粒及空泡。
       3.3 芦荟多糖对原代培养肝癌细胞形态的影响倒置显微镜下，与未加多糖干预的空白对照组相比，癌细胞在数量及形态上无明显变化(见图56)。与未加PBMC干预的癌细胞相比，芦荟多糖AP11干预及未干预的PBMC作用于癌细胞后，癌细胞形态发生明显变化，细胞混合后6 h，可见一部分细胞形态由多边形变为梭形，一部分细胞皱缩，变黑、变圆(见图710)。
       图1 PHCC体外培养6 h(200×) 图2 PHCC体外培养48 h(200×)
       3.4 芦荟多糖对原代培养肝癌细胞生长的影响MTT法体外筛选有活性的抗肿瘤药物，是目前广泛应用的细胞毒性药物筛选方法。通过比较A570值，可间接说明药物对干预细胞生长增殖的影响。本研究结果表明，与空白对照组比，芦荟多糖AP11对原代肝癌细胞生长的影响无明显差异(P>0.05);芦荟多糖AP11干预及未干预PBMC组可明显抑制肝癌细胞的生长(P<0.01)。结果见表1。表1 芦荟多糖及其干预PBMC对原代肝癌细胞生长的影响
       4 讨论
       原发性肝癌(primary hepatic carcinoma，PHC)是肝细胞或肝内胆管细胞发生的癌，临床以肝细胞癌多见，是我国常见恶性肿瘤之一，其死亡率在消化系统恶性肿瘤中列第二位。据国际癌症研究中心(IARC)估计，2000年，全球肝癌发病数为56.4万人，其中约55%在中国，且多为壮年发病，我国东南沿海如长江三角洲、珠江三角洲和广西扶绥地区都是PHC的高发区，由于死亡率较高，我国每年约有14万人死于原发性肝癌。对肝癌的防治研究引起了越来越多的关注。
       体外分离培养人癌细胞系是研究人类肿瘤必不可少的重要手段。细胞原代培养的方法，一般分为单细胞悬液培养及组织块培养法两种方法。原代培养的细胞离体时间短，生物学特性和遗传学特性与体内更为接近，无自发性变异，最适合于细胞形态、机能、分化及药敏等的实验性研究。但是原发肿瘤组织直接用于体外细胞的培养难度较大，成功率低，原因是体外模拟的培养条件与体内实际情况有很大差异。在体外生存一定时间后，细胞往往会发生衰退死亡，即使能在体外生存，也常常发生某些生物学特性的改变或丢失。本实验在比较前期组织块培养与单细胞悬液培养方法的基础上，采用胰酶短暂消化加吹打的方法分离细胞，单细胞悬液培养的方法培养细胞，实验方法简单，既可以减轻胰酶分离细胞对细胞产生的严重损伤，又减少了成纤维细胞的干扰性生长，为肝癌的临床治疗与基础研究提供了较理想模型。原代肝癌细胞分离培养成功与否，除了关键技术方法以外，还应注意以下因素：①从取材到分离培养的全过程严格执行无菌操作，防止各种微生物污染;②标本要新鲜，本实验从取材到分离结束控制在4 h以内，取材到分离前冰盒保存组织;③消化时间视所取组织硬度、大小等因素而定，及时终止消化作用;④注意选择较好质量的培养液和血清。此外，还与患者肿瘤恶性程度有密切关系，选择合适的肿瘤组织取材也是关键。原发性肝癌细胞实验模型的建立，为本实验提供了理想的体外模型。限于条件，该模型也存在一些问题，体外存活时间短，不同患者肿瘤细胞表现的活性也不相同。由于肿瘤的异质性和复杂性，不同种族和地域来源的同组织肿瘤，其细胞特性不尽相同，同时，体外实验结果与体内实际情况有明显差异，需要应用多种不同的体外模型并结合体内实验情况，才能得到较客观的结论。
       采用患者自身PBMC体外扩增再回输体内，从而提高自身免疫力、增强杀伤肿瘤活性，是治疗肿瘤的常用方法之一。本实验初步观察了显微镜下芦荟多糖AP11对肝癌细胞形态的影响，MTT法测定了芦荟多糖AP11对肝癌细胞生长的影响，结果表明，芦荟多糖AP11体外对原代肝癌细胞的生长没有明显影响，而芦荟多糖AP11干预及未干预的自体PBMC对原代肝癌细胞的形态则有明显影响，MTT实验表明其对原代肝癌细胞有较强杀伤活性。本实验研究结果提示，芦荟多糖AP11在体外没有直接的抗肿瘤活性，其抗肿瘤活性可能是通过与PBMC的相互作用，通过调节机体的免疫系统而达到的。
       【参考文献】
         　[1] 刘 军，王占民，刘 博，等. 人肝细胞癌细胞系HCC-9903的建立及其生物学特性研究[J].中华外科杂志，2001，39(11)：872.
       
       [2] 孙晓东，钟雪云. 原发性肝癌细胞原代培养制备过程中细胞分离方法的改良[J].中国病理生理杂志，1998，14(6)：767.