文章标题 全文   多个检索词，请用空格间隔。

       【摘要】 
       目的探讨青藤碱( sinomenine ,Sin)对缺血再灌注损伤大鼠脑组织保护作用及对环氧化酶-2 (cyclooxygenase-2 ,COX-2) 表达和血脑屏障通透性的影响。方法将大鼠随机分为假手术组、缺血再灌注组、Sin低剂量治疗组和Sin高剂量治疗组，线栓法建立局灶性脑缺血再灌注模型。Sin低(Sin30 mg/kg)、高剂量(60 mg/kg)治疗组于术前30 min分别给予大鼠腹腔注射。用免疫组化法观察缺血90 min再灌注24 h大鼠额顶部皮质COX-2表达及脑含水量和伊文斯蓝(EB) 含量变化，并进行2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)染色观察脑梗塞体积变化和神经症状评分。结果Sin高、低剂量治疗组神经功能缺失评分较缺血再灌注组降低，高、低剂量组之间差异亦具有统计学意义(P<0.05)。Sin高、低剂量治疗组脑梗塞体积较缺血再灌注组减小，高、低剂量组之间差异亦具有统计学意义(P<0.05)。与假手术组比较，缺血再灌注组额顶部皮质COX-2表达明显增加;与缺血再灌注组比较，Sin高、低剂量治疗组COX-2表达均显著减少(P<0.05)，高、低剂量组之间差异亦具有统计学意义(P<0.05)。与假手术组比较，缺血再灌注组脑含水量和EB 含量明显升高;与缺血再灌注组比较，Sin高、低剂量治疗组脑含水量和EB含量明显降低(P<0.05)，高、低剂量组之间差异亦具有统计学意义(P<0.05)。结论Sin对缺血再灌注脑损伤具有保护作用，其机制可能是通过抑制再灌注损伤后COX-2表达，减轻血脑屏障通透性。
       【关键词】  青藤碱; 缺血再灌注; 环氧化酶-2; 血脑屏障
       Effect of Sinomenine on the Expression of Cyclooxygenase-2 and the Permeability of the Blood-brain Barrier Following Cerebral Ischemic Reperfusion Injury in Rats
       FENG Junlin, LI Hao, JIANG Jinzi, WU Lan, LIU Kaixiang, TANG Yonggang
       (Department of Neurology,the Affiliated Hospital of Guilin Medical College ,Guilin 541002,China)
       Abstract:ObjectiveTo study the the effect of sinomenine on expression of cyclooxygenase-2 and the permeability of the blood-brain barrier of cerebral ischemia reperfusion(I/R) injury in rats.MethodsIn this experiment, rats were randomly divided into 4 groups：sham operated group, I/R group, low sinomenine treated group and high sinomenine treated group. The focal middle cerebral artery occlusion(MCAO) model was made by suture-occluded method. Sinomenine was given intraperitoneally to rats 30min before focal cerebral ischemia operation respectively . After 90min MCAO following 24h of reperfusion,the expression of cyclooxygenase-2 with immunohistochemistry were investigated.Brain water content and the content of Evens blue (EB) were investigated . TTC staining and the neurological score were also investigated.ResultsCompared with IR group, the neurological score was decreased in low and high dose sinomenine treated groups (all P<0.05). (2) Compared with I/R group, low and high sinomenine treated groups dose-dependently reduced cerebral infarction (all P<0.05). (3) Compared with sham operated group ,expression of cyclooxygenase-2 was increased at 24h reperfusion in the frontal and parietal cortex (P<0.05). Compared with I/R group, low and high sinomenine treated groups dose-dependently reduced expression of cyclooxygenase-2 (all P<0.05). (4) Compared with sham operated group, brain water content and the content of EB were increased at 24h of reperfusion. Compared with I/R groups, low and high sinomenine treated group dose-dependently reduced brain water content and the content of EB (P<0.05). ConclusionSinomenine may obviously reduce cerebral ischemia-reperfusion injury by decreasing the expression of cyclooxygenase-2 and the permeability of blood-brain barrier .It has protective effect on cerebral ischemia injury.
       Key words:Sinomenine; Ischemia-reperfusion; Cyclooxygenase-2; Blood-brain barrier
       研究表明，炎症反应是脑缺血再灌注损伤的重要病理生理机制，花生四烯酸环氧化酶途径在缺血后神经元损伤的炎症机制中具有重要作用。诱导型环氧化酶-2 (COX-2)是催化花生四烯酸合成前列腺素E2 (Prostaglandin E2，PGE2)的关键酶，而PGE2是炎症反应中最主要的炎症介质之一。青藤碱( sinomenine, Sin) 是从中药青风藤Sinomenium acutum中提取的生物碱单体，具有抗炎、免疫抑制、镇痛、降压、抗心律失常等药理作用[1,2]。体外实验表明[3]，Sin对COX-2活性有选择性抑制作用。本研究旨在观察Sin对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠COX-2活性和血脑屏障通透性的影响，从而探讨Sin脑缺血再灌注损伤的影响及机制。
       1 仪器与材料
       751分光光度计(上海仪表九厂)，青藤碱粉(湖南正清医药公司)，TTC试剂(上海医药总公司)，COX-2一抗(武汉博士德生物工程公司)。健康Wistar大鼠，雄性，清洁级，共80只，质量(250±30)g(广西医科大学动物实验中心提供)。
       2 方法
       2.1 给药方法将实验动物按随机分组原则分成假手术组(20只)、缺血再灌注组(20只)、Sin低剂量治疗组(20只)及Sin高剂量治疗组(20只)。Sin低剂量治疗组(30 mg/kg)和高剂量治疗组(60 mg/kg)均于术前30 min分别给予大鼠腹腔注射，假手术组和缺血再灌注组给予等量的生理盐水腹腔注射。缺血再灌注组和Sin低、高剂量治疗组建立脑缺血90 min再灌注24 h动物模型。
       2.2 动物模型的建立参照Longa等[4]的方法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型。采用颈外动脉插入线栓法，各组均进行左侧大脑中动脉栓塞。线栓采用石蜡线栓。线栓直径约0.27 mm，插入深度约18 mm，此时线栓头位于大脑中动脉起始部。缺血90 min时，抽提线栓实现再灌注。神经功能缺陷评分：按照 Longa等[4]的评分标准，各组分别在再灌注24 h进行评分。0分：正常，无神经学征象;1分：动物不能完全伸展右前肢;2分：动物右侧肢体瘫痪，行走时向右侧转圈，出现追尾现象;3分：动物行走向右侧跌倒，或动物不能站立或动物打滚;4分：无自发活动，有意识障碍。神经功能缺陷评分在13分为模型成功。0分和4分为模型不成功予以剔除，在后续实验中补充剔除出组的动物，以保证每组动物数不变。
       2.3 COX-2免疫组化染色再灌注24 h，各组随机取5只大鼠，用生理盐水和多聚甲醛进行心脏灌流固定，断头取脑。在左侧大脑半球距离嗅球尖端711 mm之间冠状切取约5 mm厚脑组织块，固定、脱水、包埋成蜡块，连续切片，厚5 μm。连取5张，1张作HE染色，其余4张作免疫组化染色。用SP法进行COX-2的免疫组化染色。阴性对照片用PBS液代替一抗。于每个鼠脑取1张切片，每张切片分别随机选取左侧大脑半球额顶部皮质5个不重复高倍镜视野(400×)，计数每个视野阳性细胞数，算出平均数即为每张切片阳性细胞数。
       2.4 脑含水量检测再灌注24 h，各组随机取5只大鼠，断头取脑后快速称取左右大脑半球湿重，置110115℃烤箱内烤至恒重，再分别称其干重，用(湿重- 干重) /湿重的百分比作为衡量脑含水量指标。
       2.5 血脑屏障通透性检测参照Matsuo等[5]的方法，采用EB染料检测BBB通透性。再灌注24 h，各组随机取5只大鼠，经股静脉注射2% EB生理盐水3 ml/kg。2 h后，大鼠麻醉，由左心室用生理盐水灌流至右心耳流出清亮液体，然后断头取脑，称湿质量后置入装有0.5 ml 1 mol/L KOH溶液的离心管中，37℃过夜，然后加入丙酮。离心15 min，重复3次取上清液，用751型分光光度计在波长620 nm处测定吸光度值。根据EB液的标准曲线，计算脑组织中的EB水平。
       2.6 TTC染色再灌注24 h，将各组另外5只大鼠深麻后开颅取脑。将鼠脑置于-4℃冰箱20 min后，将其切成5等份冠状位切片，置于2%TTC溶液中，水浴、多聚甲醛液固定。用计算机病理图像分析仪及梯形法计算出梗塞灶体积，各脑片梗塞灶体积之和即为梗塞体积。
       2.7 统计学方法数据处理采用SPSS13.0统计软件进行运算，结果以±s表示，组间差异显著性检验采用方差分析。
       3 结果
       3.1 各组神经功能评分的比较见表1。假手术组无神经功能缺损。与假手术组比较, 缺血再灌注组神经功能评分明显增加(P<0.05)，Sin高、低剂量治疗组大鼠的神经功能评分低于缺血再灌注组(P<0.05) ，高、低剂量组之间差异有显著性(P<0.05)。
       3.2 各组脑梗塞体积的比较见表2。TCC染色后，缺血再灌注24 h左侧大脑半球梗塞灶区呈白色，主要为额顶部皮质和尾壳核，正常组织呈红色(图1)。Sin高、低剂量治疗组梗塞体积较缺血再灌注组显著减小(P<0.05)。Sin高、低剂量组之间差异亦具有统计学意义(P<0.05)。表1 各组神经功能评分的比较
       3.3 脑含水量和EB含量的比较见表2。缺血再灌注组脑含水量和EB含量明显升高，与假手术组比较，差异具有统计学意义(P<0.05);与缺血再灌注组比较，Sin高、低剂量治疗组脑含水量和EB含量明显降低(P<0.05)，高、低剂量组之间差异亦具有统计学意义(P<0.05)。表2 各组脑梗塞体积、脑含水量和EB含量的比较与假手术组比较,△P<0.05;与缺血再灌注组比较，*P<0.05;与Sin低剂量治疗组比较，▲P<0.05;n=5
       3.4 各组COX-2表达的比较见表3。假手术组脑组织中未见COX-2阳性表达。缺血再灌注组和Sin高、低剂量治疗组COX-2 免疫阳性细胞主要存在于额顶部皮质，纹状体区亦有少量表达(图2)。Sin高、低剂量治疗组额顶部皮质COX-2表达较缺血再灌注组减少(均P<0.05);高、低剂量组之间差异具有统计学意义(P<0.05)。表3 各组COX-2表达的比较(±s)与假手术组比较，△P<0.05;与缺血再灌注组比较，*P<0.05;与Sin低剂量治疗组比较，▲P<0.05;n=5
       4 讨论
       Sin是从防己科植物青风藤中提取的生物碱单体，在治疗类风湿性关节炎及心律失常中发挥了较好疗效。梁健等[6]给予缺血再灌注大鼠青藤碱治疗，显示青藤碱对缺血再灌注脑损伤有保护作用，但具体机制尚不清楚。本实验结果也表明，脑缺血再灌注损伤大鼠给予不同剂量的Sin治疗，可明显改善神经功能评分，减少梗塞体积，对缺血脑组织有保护作用，并且高剂量Sin的脑保护效果更显著。
       图1 大鼠脑缺血再灌注24 h TTC染色 图2 缺血再灌注组COX-2阳性细胞表达(SP染色，400×)
       COX又称前列腺素合成酶(prostaglandin synthase，PGS) ,是花生四烯酸代谢转化为前列腺素(prostaglandin，PG)的催化酶。COX以二种形式存在于组织中,其中诱导型COX-2在大多数正常组织内检测不到，但在脂多糖、IL- 1等多种病理生理刺激下均可诱导表达，催化花生四烯酸生成的主要代谢产物为PGE2、PGI2和血栓素TXA2，三者至少可在脉管系统、血脑屏障和神经元本身3个环节加重缺血性脑损伤。COX-2代谢产物介导脑损伤的可能机制为：①血栓素TAX2和前列腺素具有趋化血小板和中性粒细胞粘附于血管内皮细胞作用，并促进血脑屏障开放;②增加氧自由基的生成和NO毒性效应;③加重缺血后神经细胞的凋亡，等等。姚小梅等[7]研究发现在大鼠脑缺血再灌注后COX-2阳性神经元分布多位于梗死边缘形态貌似正常的神经元和缺血边缘损伤的神经元，COX-2阳性神经元多位于梗死边缘，提示COX-2表达对缺血性半暗带神经元的生存和死亡中起重要作用。前期研究已证实[8],给予缺血再灌注大鼠COX-2抑制剂对缺血脑组织具有脑保护作用。本实验结果显示，缺血再灌组大鼠脑组织COX-2表达明显增加，脑组织内EB含量和脑含水量亦明显高于假手术组，表明缺血再灌损伤后COX-2表达增多，催化花生四烯酸代谢生成PGE2等代谢产物，促进血脑屏障开放导致脑损伤。
       近年来发现，Sin具有抑制IL-1β、IL-8的作用[9]。体外细胞培养研究发现[3]，Sin对COX-2活性具有一定的选择性抑制作用。本研究通过给予Sin治疗脑缺血再灌注损伤大鼠，显示Sin可减少再灌注损伤后COX-2表达，减少脑组织内EB含量和脑含水量，表明再灌注损伤后，Sin可通过抑制COX-2表达，减轻缺血对血脑屏障破坏，维持血脑屏障的完整性，降低脑细胞的水肿程度，发挥脑保护作用，而且高剂量Sin的脑保护效果更显著。Sin对脑缺血再灌注损伤的影响及机制是复杂的，它对脑缺血再灌注损伤后其他炎症细胞因子的影响尚有待进一步研究。
       【参考文献】
         　　[1] 班小红, 黄筑艳, 李 焱,等.青风藤化学成分的研究[J].时珍国医国药, 2008, 19(8):1831.
       
       [2] 李 乐, 张彩玲, 宋必卫. 青藤碱的药理研究与临床应用[J].中药新药与临床药理, 2006, 17(4): 310.
       
       [3] 王文君, 王培训, 李晓娟.青藤碱抗炎机理-青藤碱对人外周血单个核细胞环氧化酶活性及其基因表达的影响[J].中国中药杂志, 2003, 28(4): 352.
       
       [4] Longa EZ, Weinstein PR, Carlson S, et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke, 1989, 20(1): 84.
       
       [5] Matsuo Y, Mihara S I, Ninomiya M, et al. Protective effect of endothelin type A receptor antagonist on brain edema and injury after transient middle cerebral artery occlusion in rats[J].Stroke, 2001, 32(9): 2143.
       
       [6] 梁 健, 郑平香, 梁京生.青藤碱对脑缺血再灌注大鼠行为及脑梗塞范围的影响[J].广州医学院学报, 1999, 27(1):9.
       
       [7] 姚小梅, 王纪佐, 朱学良，等.COX-2在脑缺血再灌注后的表达[J].中华神经医学杂志, 2004, 3(3): 167.
       
       [8] 罗传铭, 毕桂南, 曹立梅, 等.塞来昔布对大鼠局灶性脑缺血再灌注的保护作用及机制研究[J].中风与神经疾病杂志, 2007, 24(2): 160.
       
       [9] 刘 良, 李晓娟, 王培训,等.青藤碱对人外周血单个核细胞IL-1β和IL-8细胞因子基因表达的影响[J].中国免疫学杂志,2002,18(4): 241.