文章标题 全文   多个检索词，请用空格间隔。

       【摘要】 
       目的探讨珠子参皂苷对HL-60细胞增殖抑制和诱导分化作用及其机制。方法MTT比色法测定细胞增殖抑制作用;细胞涂片观察细胞形态学改变;硝基四氮唑蓝(NBT)试验测定细胞还原能力;流式细胞仪(FCM)检测细胞周期。结果72 h后，最低、低、中、高浓度珠子参皂苷组的细胞增殖抑制率分别为51.86 %，42.84 %，49.13 %，66.40 %;细胞形态学观察发现珠子参皂苷组67.1 %细胞分化成熟;NBT还原能力明显增强;细胞被阻滞在G0/G1期。结论珠子参皂苷对HL-60细胞有一定的增殖抑制和诱导分化作用，其作用机理可能与阻止细胞于G0/G1期有关。
       【关键词】  珠子参; 皂苷; HL-60; 分化
       珠子参Panax japlcus var major又名扣子七，为五加科植物珠子参Panax japonicusC. A.Mey.var. major( Burk.)C. Y. Wu et K. M. Feng或羽叶三七Panax japonicus C. A. Mey. var. bipinnati-fidus( Seem) C. Y. Wu et K. M. Feng的干燥根茎，主要分布于东喜马拉雅至我国西部山区[1]。它的根茎为药材珠子参，具活血散瘀、补血止血、消肿止痛之功。目前已从珠子参各种属珠子参根茎及叶中共分离出25个皂苷，多数为三萜皂苷[2]。从结构上分析，珠子参皂苷极可能具有诱导肿瘤细胞分化的作用。但到目前为止，珠子参皂苷用于抗肿瘤方面的研究还非常少。本文以人早幼粒白血病HL-60细胞株为对象，用体外细胞培养的方法，初步探讨了珠子参皂苷抗癌及诱导肿瘤细胞分化的作用。
       1 材料
       1.1 细胞株人早幼粒白血病HL-60细胞株，购自上海中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。
       1.2 药品与试剂珠子参，产于湖北省神农架林区，经宜昌市药品检验所鉴定。珠子参总皂苷提取方法见参考文献[3]。在超净工作台中，将珠子参皂苷粉末溶于RPMI-1640培养基中，浓度为2 000 μg /ml，经0.22 μm微孔滤膜过滤除菌后，保存于4℃冰箱中备用。
       1.3 仪器EPLCS XL-4 流式细胞分析系统;Suprafuge 22高速冷冻离心机;GENios多功能酶标仪。
       2 方法
       2.1 实验分组阴性对照组(BL组)：含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液;阳性对照组(ATRA组)：加入全反式维甲酸ATRA溶液，并使终浓度为含10 %胎牛血清100 μg /ml药液(ATRA浓度参照文献[4]);珠子参皂苷组(PJ组)：加入珠子参皂苷药液，并使终浓度为含10 %胎牛血清和800，400，200，100 μg /ml药液4个浓度组，经过细胞毒实验后，确定一个最佳浓度组作为珠子参皂苷组。以上各组培养液均调整pH值为7.2。
       2.2 细胞培养细胞培养方法参照文献[5]。HL-60细胞复苏后在含10%小牛血清的RPMI-1640培养液、5%CO2、37℃条件下传代培养，至对数生长期后，分组，加入相应培养基及血清后，调整细胞浓度至2×105个/ml。
       2.3 细胞毒实验方法参照文献[6]，每组一瓶各取细胞悬液接种于96孔培养板，每组3板，每板设5个平行孔，每孔100 μl，分别在加入血清后24，48和72 h时加入20 μl MTT贮液，使MTT浓度为0.9 mg/ml，继续温育4 h，超速低温离心1 000 r/min，5 min，直接翻板法甩干上清，加入10% SDS 100 μl/孔，振荡5 min，摇匀，以完全溶解微小紫蓝色结晶，迅速于酶标仪570 nm处测定各孔吸光度(OD值)。
       细胞杀伤率(%)=1-实验组OD均值对照组OD均值×100%
       2.4 细胞形态学分级每瓶细胞悬液离心，弃上清，取沉淀涂片，迅速风干，Wright-Giemsa染色10 min，蒸馏水轻轻冲洗，风干后，油镜下观察，记数200个细胞，分级标准参照文献[7]。
       2.5 细胞NBT还原能力检测细胞培养至对数生长期后，将药物加入细胞悬液中，并将细胞终浓度调成1～5×105个/ml，细胞共分3组：阴性对照组、阳性对照组、珠子参皂苷组，培养72 h后，将各组细胞悬液离心，弃上清，加入0.1% NBT溶液0.5 ml和TPA溶液20 μl，37℃孵育1 h后，各组细胞离心，弃上清，取沉淀涂片，迅速风干，Wright-Giemsa染色10 min，PBS轻轻冲洗，风干后油镜下随机计数200个细胞，细胞内有蓝黑色颗粒者为NBT阳性细胞，计算阳性细胞百分率。
       2.6 FCM细胞周期分析细胞培养至对数生长期后，将药物加入细胞悬液中，再培养72 h后，将各组细胞悬液离心，弃上清，用PBS轻轻洗涤2次，并调整细胞浓度为1～5×106个/ml，4℃下用75 %乙醇固定30 min，含Rnase及碘化丙啶(PI)染色液染30 min后上流式细胞仪检测DNA含量的变化，分析细胞周期变化，并以增殖指数(proliferationdex,PI)表示药物对细胞分裂增殖的影响。
       2.7 资料统计分析方法数据采用单因素方差分析，应用SPSS10.0在PC上进行处理。并采用SNK法进行组间比较。
       3 结果
       3.1 细胞毒作用结果见表1，可以看出，与阴性对照组相比较，药物作用24，48，72 h后，珠子参皂苷各不同浓度组和阳性对照组的OD值均明显小于阴性对照组，且均有显著性差异(P<0.01)，说明珠子参皂苷有抑制HL-60细胞生长的作用。而且珠子参皂苷对HL-60细胞的生长抑制作用随着药物作用时间的延长，效果也随之增强。由于珠子参皂苷对HL-60细胞抑制作用最低浓度组作用虽比高浓度组弱，但比低、中浓度组强，考虑到药物浓度过高，对细胞有杀伤作用，以及有的中药有双向调节作用，所以选择珠子参皂苷最低浓度(100 μg /ml)作为珠子参皂苷浓度，以后所提到的珠子参皂苷组均为珠子参皂苷最低浓度组。表1 不同药物在不同时间对HL-60细胞生长的影响与阴性对照组比较，*P<0.01;n=5
       3.2 细胞形态分级本次实验显示，在药物作用72 h后，光镜下阴性对照组中的HL-60细胞呈原始未分化状态，体积大而圆，胞浆较少，含有少量嗜天青颗粒，胞核大、圆形或椭圆形，染色质细，核仁大而圆，常为2～3个，而阳性对照组和珠子参皂苷组的大部分细胞分化为中、晚幼粒细胞，胞体变小，呈圆形或椭圆形，胞核小，核仁减少或消失，核染色质变粗，核/浆比例下降，胞浆中出现特异性颗粒，部分呈杆状核和分叶核细胞，见图1～5。各组细胞形态分化率见表2，从此表可以看出，与阴性对照组相比，阳性对照组和珠子参皂苷组的早幼粒细胞比值明显下降(P<0.01);而中幼粒细胞和晚粒细胞比例都明显增高(P<0.01)，且出现杆状核或分叶核细胞，说明HL-60细胞在珠子参皂苷作用下从形态学方面向成熟细胞方向的改变。表2 不同药物对HL-60细胞形态学影响
       3.3 NBT细胞还原能力由表3可以看出，药物作用72 h后，阳性对照组NBT阳性细胞占73.9%，珠子参皂苷组NBT阳性细胞占62.3%，与阴性对照组(7.1%)相比较，阳性对照组和珠子参皂苷组NBT阳性细胞均明显增多(P<0.01)。说明HL-60细胞在珠子参皂苷的作用下，在功能和生化学变化方面向成熟细胞方向的改变。表3 不同药物对HL-60细胞NBT还原能力的影响
       3.4 FCM周期分析流式细胞仪检测结果表明，在药物作用72 h后，阳性对照组和珠子参皂苷组的G0/G1期细胞都增多(61.78 %，48.62 %)，S期细胞都减少(18.42 %,30.38 %)，与阴性对照组(39.64 %，37.52 %)相比有显著性差异(P<0.01)。说明珠子参皂苷和ATRA都可使HL-60细胞阻断在G0/G1期，使DNA合成受抑制，从而干扰了HL-60细胞在细胞周期中的进程。结果见表4。而且从增殖指数的变化可以看出，珠子参皂苷可以抑制细胞增殖。DNA含量分布图见图6。表4 不同药物对HL-60细胞周期影响
       4 讨论
       HL-60细胞最大特点是在分化诱导剂作用下可向粒细胞系统或巨噬细胞系统两个方向分化，广泛应用于分化诱导剂的寻找和分化诱导剂的作用机理研究。本实验结果表明,珠子参皂苷对HL-60细胞的生长有抑制作用，其特点有两点：①对HL-60细胞的生长抑制作用与珠子参皂苷作用的时间存在依赖性，随着作用时间的延长，其抑制作用增强。②对HL-60细胞的生长抑制作用与珠子参皂苷的剂量不存在依赖性，随着珠子参皂苷浓度的加大其抑制作用并没有加强，其机理可能与中药的双向调节有关，有待进一步研究。
       珠子参皂苷诱导HL-60细胞分化的作用主要有以下两个方面的表现 ：
       ①形态学方面：成熟的白细胞由造血干细胞分化而来，粒细胞一般按原始粒细胞——早幼粒细胞——中幼粒细胞——晚幼粒细胞——杆状核及分叶核细胞逐渐分化成熟。本次实验的结果表明，药物作用72 h后， HL-60细胞在珠子参皂苷作用下从形态学方面向成熟细胞方向的改变。②功能和生化学方面：正常的中性粒细胞或分化的细胞，在TPA(佛波酯)的激发下，细胞内超氧阴离子产生增多，NBT在分化细胞中接受由NADPH来的氢，还原为不溶性的蓝黑色颗粒，可在显微镜下清楚看到着色斑。本次实验的结果表明，药物作用72 h后，与阴性对照组相比，珠子参皂苷组的NBT阳性细胞(62.3%)明显增多，有显著性差异(P<0.01)，说明HL-60细胞在珠子参皂苷的作用下，在功能和生化学变化方面向成熟细胞方向的改变。
       流式细胞仪是当前较先进的技术,它能快速、准确、简便地分析细胞周期各时相分布，本次实验应用FCM分析细胞周期，结果表明，在药物作用72 h后，珠子参皂苷组的G0/G1期细胞增多(48.6 %)，S细胞减少(30.38 %)，与阴性对照组相比较，有显著性差异。说明珠子参皂苷可以使HL-60细胞被阻断在G0/G1期，阻止细胞进入S期，使DNA合成受抑制，减少细胞增殖。也可能是由于细胞分化成熟，不再增殖。有人认为在细胞周期的G1期可能存在控制细胞周期的限制点(RP)，珠子参皂苷通过阻止这一位点，可能会使细胞从增殖走向分化。
       【参考文献】
         　　[1] 国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部[S]. 北京: 化学工业出版社,2005:192.
       
       [2] 赵 仁,赵 毅,李东明,等. 珠子参的研究进展[J]. 中国现代中药, 2008, 10(7):3.
       
       [3] 朱新华,后文俊，李存德. 珠子参总皂甙对脾细胞增殖效应影响的研究[J].昆明医学院学报,1994,15(1):65.
       
       [4] 李勤喜,刘颖梅,李一志,等. 维甲酸抗肿瘤作用的研究进展[J].甘肃教育学院学报,1999,3(2):41.
       
       [5] 鄂 征. 组织培养和分子细胞学技术[M].北京:北京出版社,1995:133.
       
       [6] 朱立平,陈学清.免疫学常用实验方法[M].北京:人民军医出版社,2000:193.
       
       [7] 韩 锐. 抗癌药物研究与实验技术[M].北京:北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1997.