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       【摘要】 
       目的研究不同培养基成分对金铁锁愈伤组织生长和皂苷积累规律的影响。方法改变培养基中碳源、氮源、磷酸盐、钙盐的浓度，比色法测定愈伤组织中皂苷的含量。结果金铁锁愈伤组织生长和皂苷积累的最适培养基成分为蔗糖40 g·L-1，KNO3∶NH4NO3为（1.9：1.65）g·L-1，1 mmol·L-1KH2PO4，4.5 mmol·L-1CaCl2。结论蔗糖作为碳源最有利于金铁锁愈伤组织生物量的积累和金铁锁皂苷的生物合成。混合氮源有利于金铁锁愈伤组织生长和皂苷含量的积累。
       【关键词】  金铁锁； 愈伤组织； 皂苷含量； 培养基成分
       金铁锁Psammosilenet unicoides W.C Wu et C.Y Wu是石竹科金铁锁属单种属植物，其根入药，用于跌打损伤、胃痛、风湿痛、创伤出血等的治疗［1］，是我国中成药保密品种“云南白药”的重要成分之一。金铁锁化学成分主要为三萜皂苷及环肽类化合物［2，3］。研究称金铁锁皂苷在抗炎镇痛作用中效果显著［4］。近年来，由于自然生长慢、滥采滥挖、环境恶化、市场需求增加等多方面原因，造成金铁锁资源数量急剧下降，成为《中国植物红皮书》中的国家二级重点保护的珍稀濒危物种［5，6］。而利用组织培养技术生产金铁锁的替代产品，即可满足市场的需求也是保护野生种质资源必由之路，成为解决金铁锁药用资源匮乏问题的重要手段之一。
       目前，对金铁锁皂苷类物质的研究主要集中在其药理药效方向，对金铁锁愈伤组织培养过程中次生代谢产物调控的研究目前尚未见报道。本实验通过改变不同培养基成分，研究金铁锁愈伤组织生长及皂苷积累的规律，以期为利用组织培养技术规模化生产金铁锁皂苷类物质提供理论依据。
       1  材料
       选取大连工业大学细胞工程实验室盆栽金铁锁幼嫩茎为外植体。
       2  方法
       2.1  愈伤组织诱导与培养外植体经流水冲洗后用Tween20浸泡25 min，冲洗3次，0.1%HgCl2处理8 min，无菌水洗3次，经75%乙醇处理8 s，无菌水洗3次，无菌滤纸吸干水分，然后切成1～1.5 cm的茎段进行接种。所用诱导培养基为MS固体培养基（2,4-D 0.5 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1+KT 0.1 m·L-1+3%蔗糖+0.8%琼脂，pH 5.8），(25±1 ) ℃下暗培养。外植体接种6 d左右，切口处开始膨胀；10 d左右开始长出乳白色愈伤组织；20 d左右愈伤组织逐渐覆盖外植体，在25 d时挑选质地松散、生长良好的愈伤组织，称重后继代培养，25 d后收获称重。
       2.2  金铁锁愈伤组织测量指标
       干重增量=最终收获干重－接种干重量
       金铁锁皂苷产量=干重增量×金铁锁皂苷含量
       鲜重称量：从培养瓶中取出愈伤组织，用滤纸吸净其表面水分后称重。干重称量：将收获的愈伤组织置于50℃下干燥至恒重。实验重复3次取平均值。
       2.3  金铁锁皂苷含量测定
       2.3.1  金铁锁皂苷的提取 将获得的愈伤组织干燥粉碎并准确称取2.00 g，加入20倍量80%乙醇超声波（频率：40 kHz,功率：500W）提取100 min，过滤得醇提液，挥干试剂得醇提物。将此醇提物用适量水溶解，用正丁醇（4∶3∶3）萃取3次。正丁醇萃取液蒸发至干，用甲醇溶解并定容至10 ml，得金铁锁皂苷提取液。
       2.3.2  金铁锁皂苷含量的测定 目前国内尚无金铁锁皂苷类成分的法定对照品，本实验选择人参皂苷Re为对照品，采用香草醛-高氯酸比色法测定金铁锁总苷含量。
       对照品溶液的制备：精密称取人参皂苷Re标准品5 mg，加甲醇10 ml，振荡，摇匀，待用。
       标准曲线的绘制：分别吸取0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7 ml人参皂苷Re对照液置于具塞试管中，水浴挥干试剂，加入5%香草醛-高氯酸溶液0.2 ml和高氯酸0.8 ml，65℃下水浴20  min ,立即用冰水冷却至常温，加入5 ml冰醋酸，摇匀静置后于λ=540 nm下测定吸光度，以样品浓度为横坐标，吸光度纵坐标，绘制标准曲线。以此方法得回归方程为：A=1.628 3C-0.002 3，r=0.999 1。
       金铁锁皂苷含量测定：精取金铁锁皂苷提取液0.5 ml，置于具塞试管中，按标准曲线操作。用回归方程计算金铁锁皂苷的含量，折算成愈伤组织中的含量和每升培养基的产量。
       3  结果
       3.1  不同碳源对金铁锁愈伤组织生长及皂苷含量积累的影响 由表1可知，蔗糖作为碳源对金铁锁愈伤组织的生长及皂苷积累影响作用最为显著。白砂糖影响效果次于蔗糖，但明显高于麦芽糖和葡萄糖。表1  不同碳源对金铁锁愈伤组织生长及皂苷含量积累的影响（略）
       3.2  不同蔗糖浓度对金铁锁愈伤组织生长和皂苷含量积累的影响 由图1知，干重增量和皂苷产量均随蔗糖浓度增加而增大,在蔗糖40～50g·L-1的时候达到最高,随后随浓度增大而迅速降低。综合分析，以蔗糖40g·L-1为最优碳源浓度。
       3.3  氮源对金铁锁愈伤组织生长和皂苷含量积累的影响 由表2可知，KNO3与NH4NO3混合添加的时候，干重增量达到最高，皂苷含量积累也呈现较优状态。单独加KNO3作用效果不明显，单独加NH4NO3作用效果较好并随浓度增加而增大。综合分析，混合氮源利于金铁锁愈伤组织生长和皂苷的积累，KNO3∶NH4NO3为（1.9∶1.65）g·L-1时效果最佳。表2  氮源对金铁锁愈伤组织生长及皂苷含量积累的影响（略）
       3.4  不同浓度磷酸盐对金铁锁愈伤组织生长及皂苷积累的影响 由图2可知，在KH2PO4小于1.00 mmol·L-1时，金铁锁愈伤组织干重增量和金铁锁皂苷产量增加迅速，在1.00 mmol·L-1时两者达到最高，并随着浓度增加而减小。因此，KH2PO4浓度为1 mmol·L-1时为愈伤组织生长和金铁锁皂苷合成的最佳浓度。
       3.5  钙盐对金铁锁愈伤组织生长及皂苷积累的影响 由图3可知，愈伤组织干重增量随着CaCl2浓度的增加而增大，在浓度为4.5mmol·L-1时达到最大，大于4.5 mmol·L-1时随着浓度增加而减少。皂苷量在CaCl2浓度为3 mmol·L-1之前增加迅速，在3～4.5 mmol·L-1时相差不大，均处于较优状态，大于4.5 mmol·L-1时随浓度增加而减少。综合考虑，CaCl2浓度为4.5 mmol·L-1时为最佳浓度。
       4  讨论
        
       培养基成分对愈伤组织的生长及次生代谢产物的积累具有重要影响。碳源是细胞生长的能量来源及构成细胞骨架的重要成分，培养基中糖类不仅起到碳源作用，还可以调节细胞渗透压，其种类及浓度对细胞生长及次生代谢产物的积累影响显著［7］。研究表明，金铁锁愈伤组织培养中蔗糖为最佳碳源，其中4%的蔗糖浓度最有利于细胞生长及皂苷物质的积累。同等条件下，蔗糖培养的愈伤组织干重增量及皂苷产量均明显高于葡萄糖和麦芽糖，可能是蔗糖作为两分子糖比单一葡萄糖作用要更为全面。同时发现蔗糖和白砂糖的作用效果较为相似，进行规模化生产开发金铁锁时可选用白砂糖为碳源，以降低生产成本。氮是细胞核酸及生物体内酶的重要组成成分，主要以氨态氮（NH4+）和硝态氮（NO3-）两种形式存在，在植物体内先转化为氨基酸在转化为蛋白质后被植物吸收利用。其种类及浓度对细胞生长及次生产物合成具有显著效果［8］。本实验研究发现，单独使用NH4NO3或两者混合使用效果均优于单独使用KNO3，说明混合氮源利于金铁锁愈伤组织细胞生长及皂苷产物的合成，KNO3∶NH4NO3的最优质量比值为1.9∶1.65 g·L-1。磷元素在生命活动中具有重要地位，植物细胞培养中通常由磷酸盐提供细胞活动所需磷元素［9］。本研究中，1 mmol·L-1KH2PO4最有利于金铁锁愈伤组织生物量积累及皂苷产物的合成。钙离子作为细胞生长的必须营养元素，在植物细胞中起着重要的信使作用［10］，调节着细胞的生长及次生代谢产物的合成。本研究发现，影响金铁锁愈伤组织细胞生长及皂苷产物积累的最佳钙离子浓度为4.5 mmol·L-1。
       本文通过研究不同碳源、氮源、磷酸盐和钙盐对金铁锁愈伤组织生长及皂苷含量积累的影响，明确了金铁锁细胞培养的适宜条件，为下一步大量培养金铁锁愈伤组织及规模化生产金铁锁皂苷物质奠定了基础。
       【参考文献】
         　　［1］王学勇,邱德文,蒋朝晖.苗族药物金铁锁研究进展［J］.中国中医基础医学杂志,2002,8(11):77.
       
       ［2］钟惠民,华燕,倪伟,等.金铁锁的两个新三萜皂苷［J］.云南植物研究,2003,25(3):361.
       
       ［3］丁中涛,汪有初,周 俊,等.金铁锁根中的环肽成分［J］.云南植物研究,2002,22(3):331.
       
       ［4］王学勇,许建阳,邱德文，等.金铁锁总皂苷抗炎镇痛作用及作用机理研究［J］.中国实验方剂学杂志,2006,12(5):56.
       
       ［5］中国科学院植物研究所.中国植物红皮书，第1册［M］.北京:科学出版社,1991.
       
       ［6］中华人民共和国国务院.国家重点保护野生植物名录，第一批［S］.国务院,1999.
       
       ［7］SmithMAL,Madhavi D L，FANG Y，et a1．Continuous cell culture and product recovery from wild Vaccinium pahalae［J］.Journal of Plant Physiology,1997,150(5):462.
       
       ［8］Kim Seung-heui,Kim Seon-kyu.Effect of nitrogen source on cell growth and anthocyanin production in callus and cell suspension culture of Sheridan grapes［J］.Journal of Plant Bioteehnology,2002,4(2):83.
       
       ［9］唐克轩.中草药生物技术［M］.上海:复旦大学出版社,2003:128.
       
       ［10］赵 昕,裴真明,何奕昆.胞外Ca2+信号-动植物中的第一信使［J］.遗传,2007,29(3):269.