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       【摘要】 
       目的从基因水平探讨更年期抑郁症与5-HT1A受体亚型转录水平的相关性及中医药干预作用。方法对雌性成年大鼠采用去势+孤养+改良的慢性不可预见应激建立更年期抑郁症模型;将去势大鼠随机分为更年期组、模型组、西药组(百优解联用雌激素)、中药组(一解合方)，并以假手术组为对照。采用RT-PCR法测定海马、皮质神经元中5-HTR1A mRNA转录水平，应用GIS-2010凝胶图像分析系统照相、读取灰度值。比较分析各组之间的差异。结果模型组大鼠海马、皮质5-HTR1A mRNA转录水平低于假手术组，有显著性差异(P<0.01);中药组大鼠海马、皮质5-HTR1A mRNA转录水平显著高于模型组、西药组(P<0.01)。结论更年期抑郁症在基因水平的发生机理可能是由于5-HTR1AmRNA转录功能受到破坏，中药一解合方可通过影响海马、皮质突触后5-HTR1A mRNA转录水平而发挥治疗作用。5-HTR1A mRNA的转录水平可作为药物治疗新靶点，值得进一步研究。
       【关键词】  更年期抑郁症; 5-HTR1A mRNA; 中医药; 一解合方
       近年来，随着分子生物学的不断发展，5-羟色胺受体在抑郁症的发病学说中引起很大重视。突触间隙5-HT作为神经递质必须与其相应的受体结合方可进行信息传递。前期研究[1]显示5-HTR1A与更年期抑郁症发病密切相关，本实验拟从基因水平进一步探讨5-HTR1A mRNA在更年期抑郁症发病中的病理机制，以期寻找药物作用新靶点，为临床治疗提供新思路。
       1 材料与仪器
       1.1 动物与分组雌性Wistar清洁级大鼠50只，体质量(210±20)g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。
       采用Open-Field法进行行为学测定后，将水平运动和垂直运动总得分≤30分或≥120 分、体质量≥230 g或≤190 g的大鼠，予以剔除，共选取 43 只评分及体质量相近的大鼠，按随机数字表法分为5组：①假手术组;②更年期组(去势);③更年期抑郁症模型组(去势+应激);④西药组(去势+应激+百优解联用雌激素);⑤中药组(去势+应激+一解合方)。其中假手术组和更年期组各8只，模型组、中药组、西药组各9只。
       1.2 药品中药一解合方浸膏(药物组成：熟地30 g，北沙参20 g，麦门冬20 g，厚朴10 g，陈皮10 g，半夏15 g，茯神15 g，苏梗10 g，石菖蒲6 g，郁金10 g，砂仁6 g等)，由天津中医药大学中医药研究研究院制剂室提供。西药：百优解(Eli Lilly and Company Limited，批号：A140885)，用蒸馏水配成0.4 mg/ml混悬液，4℃保存，使用时充分摇匀。苯甲酸雌二醇注射液(天津金耀氨基酸生产有限公司，批号：0505111)。
       1.3 仪器及试剂紫外分光光度计(BioPhotometer) (德国Eppendorf公司)，台式高速冷冻离心机(3K18)(美国Sigma公司)，PCR扩增仪(TH-48a)(杭州大和热磁有限公司)，多功能电泳仪(北京六一仪器厂)，全自动凝胶图像分析系统(上海天能科技公司)。
       ImProm-Ⅱ反转录酶、dNTP、随机引物pd(N)6购自美国Promega公司;异硫氰酸胍、DEPC、和β-巯基乙醇等购自美国Simga公司;Taq DNA聚合酶、Tris碱、水饱和酚、超纯水和DNA分子量标准Marker等购自北京鼎国生物技术有限公司;其它生化试剂均为国产分析纯。
       2 方法
       2.1 造模方法各组大鼠常规喂养1周后，术前禁食24 h，第2天进行手术。①模型、中药、西药和更年期4组大鼠行卵巢摘除术，10%水合氯醛(300 mg/kg体质量)腹腔注射麻醉，背位固定，于下腹部正中切开，逐层进入腹腔，结扎并剪去其双侧卵巢。术后1周阴道涂片，连续5 d阴道监测未见动情周期证明去势成功。②假手术组大鼠模型 手术方法同卵巢摘除术类似，但不切除卵巢，仅结扎、并摘取卵巢附近少许脂肪组织。③对去势成功后的模型、中药、西药3组大鼠进行慢性不可预见性应激(参考文献[2]并加以改良)。将大鼠每笼1只饲养，并给予21d各种不同的应激，包括电击足底(强度5 mA，每隔20s刺激1次，持续30 min)，冰水游泳(8℃，5 min)，热应激(45℃，5 min)，摇晃(1次/s，15 min)，夹尾(1 min)，禁水(24 h)，禁食(48 h)和昼夜颠倒等刺激，上述8种刺激每天随机选取一种，每项刺激至少进行2次，同种刺激不连续进行。
       2.2 给药方法于应激开始同步给药，采用灌胃方式，连续21 d。假手术组、更年期组和模型组的大鼠均给予蒸馏水，剂量为10 mg/(kg·d);中药组大鼠给予一解合方浸膏，其用药量为8 g[相当于生药16 g/(kg·d)];西药组大鼠给予百优解混悬液，并肌注苯甲酸雌二醇，隔日1次。其百优解混悬液用药量为4 mg/(kg·d)，苯甲酸雌二醇，用药剂量每次为0.2 mg·kg。中西药用药剂量均根据人的日用药量，按大鼠体表面积比率换算成等效剂量。
       2.3 指标检测及方法测定海马和皮质神经元中5-羟色胺受体亚型：5-HTR1A mRNA的转录水平。采用RT-PCR法进行检测，具体操作如下。
       2.3.1 检测基因的引物设计与合成按照引物设计原则及所需实验条件，我们根据Genbank核酸数据库中的大鼠5-羟色胺1A受体(5-HTR1a)和看家基因G3PDH基因序列设计引物。引物序列见表1。全部引物由上海生物工程有限公司合成,经 PAGE纯化。表1 引物序列、位置和扩增片段长度
       2.3.2 RNA的提取(参照Promega的RNAgents ② 总RNA提取试剂盒)①取约0.05 g组织放入预冷的含0.5 ml RNA裂解液的匀浆器中，加入3.5 μl β-巯基乙醇，匀浆至透清。②将匀浆好的液体转入离心管中，依次加入50 μl的2M NaAC(pH4.0)， 0.5 ml水饱和酚和100 μl氯仿/异戊醇(49∶1)，剧烈振荡充分混匀，冰浴15 min，每隔2～3 min混匀一次。③4℃ 14 000 r/min离心15 min，小心吸取上清。注意不要吸出界面的蛋白层。④加入等体积酚/氯仿混合液，混匀，冰浴15 min。⑤4℃ 14 000 r/min离心15 min，小心吸取上清。⑥上清加入等体积异丙醇，-20℃沉淀1 h以上。⑦4℃ 14 000 r/min离心20 min，弃上清，预冷75%乙醇漂洗，室温干燥。⑧溶于50 μl DEPC水中。⑨取2 μl电泳检测RNA完整性。紫外分光光度计检测RNA浓度。
       2.3.3 逆转录反应每个反应取2 μg总RNA、随机引物：pd(N)6 2 μl和DEPC水，合计11.6 μl混合，70℃热变性10 min，迅速冰浴冷却3 min。其它试剂按下列体系(见表2)加入后混匀，37℃ 90 min。表2 反应体系
       2.3.4 PCR反应条件优化及PCR扩增反体系结果见表3～4。表3 最佳PCR反应条件表4 PCR扩增体系表
       2.3.5 凝胶电泳分析取PCR产物5 μl，2%琼脂糖凝胶上电泳，溴化乙锭(EB)染色，应用GIS-2010凝胶图像分析系统照相、读取灰度值并进行分析。
       2.4 统计学处理应用spss11.5软件包进行统计学处理。全部实验数据用±s表示，多组间均数比较采用单因素方差分析。
       3 结果
       3.1 总RNA检测分析见图1。图1 总RNA电泳图
       3.2 海马5-HTR1A mRNA的半定量RT-PCR分析以管家基因G3PDH为参照，分析5-HTR1a在各组间的不同表达。见图2～3及表5。M.代表DNA分子量标准 1～6.中药组 7～12.西药组13～18.模型组 19～24.更年期组 25～30.假手术组图2 G3PDH基因RT-PCR产物电泳图M.代表DNA分子量标准 1～6.中药组7～12.西药组 13～18.模型组 19～24.更年期组25～30.假手术组图3 5-HTR1AmRNA基因RT-PCR产物电泳图表5 各组大鼠海马5-HTR1AmRNA转录水平的比较各组大鼠海马5-HTR1A mRNA转录水平的比较，模型组大鼠低于假手术组，有极显著性差异(P<0.01);中药组高于模型组、西药组，均有极显著性差异(P<0.01)，略低于假手术组，但无差异(P>0.05 );西药组高于模型组，但无差异(P>0.05 )，低于假手术组，有显著性差异(P<0.01);更年期组低于假手术组，差异显著(P<0.01)。
       3.3 皮质5-HTR1AmRNA的半定量RT-PCR分析以管家基因G3PDH为参照，分析5-HTR1a在各组间的不同表达。结果见图4～5及表6。　　M-代表DNA分子量标准 1～6.中药组 7～12.西药组13～18.模型组 19～23.更年期组 24～28.假手术组图4 G3PDH基因RT-PCR产物电泳图　　M-代表DNA分子量标准 1～6.中药组 7～12.西药组13～18.模型组 19～23.更年期组 24～28.假手术组图5 5-HTR1AmRNA基因RT-PCR产物电泳图表6 各组大鼠皮质5-HTR1AmRNA转录水平的比较各组大鼠皮质5-HTR1A mRNA转录水平的比较，模型组低于假手术组，有显著性差异(P<0.01);中药组高于模型组、西药组，均有显著性差异(P<0.01)，低于假手术组，差异显著(P<0.01);西药组高于模型组，差异显著(P<0.01)，低于假手术组，有显著性差异(P<0.01);更年期组低于假手术组，有显著性差异(P<0.01)，但高于模型组，差异极显著(P<0.01)。
       4 讨论
       5-HT在中枢涉及调节情感、睡眠、警觉、记忆、食欲、性欲等多种功能，5-HT前体色氨酸有提高情绪的作用，5-HT耗竭剂能使抑郁症状加剧;抑郁症自杀患者脑脊液中5-HT及其代谢产物5-HIAA含量下降，其降低程度与症状严重成正比。
       目前临床所用抗抑郁药物均可快速增加突触间隙5-HT浓度，然而发挥抗抑郁效应却在治疗2～3周后。2～3周的起效潜伏期提示，5-HT浓度的增加仅仅是发挥抗抑郁作用的初始环节，抑郁改善之前突触前后的5-HT系统一定有长时程适应性改变，推测可能同5-HT受体的正负反馈调节有关。
       随着分子生物学的研究进展，5-HT1A受体与抑郁症及抗抑郁剂的机理正在逐渐被阐明。5-HT1AR含有421个氨基酸，属G蛋白偶联受体家族。在抑郁症中， 5-HT1A自身受体超敏，抑制钙通道的活性，使钙电流减少而缩短动作电位时程，5-HT的释放量相应减少[3];突触后膜5-HT1AR主要调节5-HT释放。5-HT1AR转导机制主要是偶联G蛋白，抑制腺苷酸环化酶(AC)。虽然有许多5-HT1AR与抑郁症的报道，但未获一致的肯定。很多研究者认为在抑郁症中，海马突触后膜的5-HT1A受体低敏状态可能是通过“5-HT1A受体-G蛋白偶联-cAMP信号转导”系统介导的。
       急慢性应激后相关脑区5-HT1A受体mRNA的表达降低，可能会对大脑结构和功能造成损害。海马结构富含各种信使受体，尤其是皮质激素、兴奋性氨基酸和5-HT1A受体，在应激反应中，它不仅是高位调节中枢，更是受应激累及的最敏感区域。
       现代研究显示啮齿类、灵长类和人类抑郁症中前额叶皮质都有密集的5-HT神经轴突支配，并有各种5-HT受体分布，其中最丰富的为5-HT1A受体。
       本研究结果发现模型组大鼠海马、皮质5-HTR1AmRNA转录水平显著下降，这与近期国外报道一致[4]。尸检研究发现在重型抑郁症患者海马突触后5-HT1A受体mRNA减少，抑郁症自杀患者也观察到突触后5-HT1A信号转导减少[5]。5-HTR1AmRNA转录水平低下可否作为抑郁症诊断及治疗的直接判定标准有待进一步研究。
       本研究亦显示经中药一解合方治疗后，更年期抑郁症大鼠海马、皮质5-HTR1AmRNA转录水平明显升高，与模型组、西药组比较均有显著性差异(P<0.05)，与假手术组比较无差异(P>0.05)，提示一解合方在基因水平是通过影响突触后5-HT1ARmRNA转录水平而发挥抗抑郁作用。突触后5-HT1ARmRNA转录水平有可能正是中医治病求本之“本”，有待进一步证实。
       【参考文献】
         　　[1] 刘艳玲，宋卓敏，丁 雨.一解合方对更年期抑郁症大鼠海马、皮质5-HTR1A表达的影响[J].四川中医，2009,27(4):10.
       
       [2] 董 莉, 吕 嵘,洪 岩.补肾解郁清心方对更年期抑郁症模型大鼠HPO轴及单胺类神经递质的影响 [J]. 上海中医药大学学报，2003,17(2):38.
       
       [3] Claus N，Kristin C. Selective modulation of Ca2+ influx pathways by 5-HT regulates synaptic long-term plasticity in the hippocampus[J]. Brain Research，2005，1037: 187.
       
       [4] Arango V，Underwood MD，Boldrini M，et al. Serotonin IA receptors，serotonin transporter binding and serotonin transporter mRNA expression in the brainstem of depressed suicide victims[J]. Neuropsychopharmacology，2001，25:892.
       
       [5] Stockmeier CA. Invovlement of serotonin in depression: evidence from postmortem and imaging studies of serotonin receptors and the serotonin transporter[J]. J Psychiatr Res，2003，37(5):357.