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       【摘要】 
       目的探讨肾炎Ⅱ号水丸(SY)对紫癜性肾炎(HSPN)小鼠肾系膜区CD71表达的影响。方法口服麦胶蛋白+尾静脉注射印度墨水的方法建立小鼠HSPN模型。17周后考马斯亮蓝法测各组小鼠24 h尿蛋白量(UPE);苦味酸法测血清肌酐(Scr)含量;免疫荧光法观察肾脏系膜区IgA沉积和CD71受体表达情况。结果模型组UPE较空白组明显增多(P<0.01)，SYH组、SYM组UPE较模型组明显减少(P<0.01)。与空白组比较，模型组IgA呈团块状在系膜区沉积明显增多(P<0.05);与模型组比较，SYH组IgA沉积明显减少(P<0.01)，SYM组IgA沉积明显减少(P<0.05)。与空白组比较，模型组肾系膜区CD71受体表达明显降低(p<0.01);与模型组比较，SYH组、SYM组表达明显增加(P<0.01)，SYL组表达明显增加(P<0.05)。结论SY增加HSPN模型肾系膜区CD71的表达从而促进系膜区IgA的清除可能是其治疗HSPN的机理之一。
       【关键词】  肾炎Ⅱ号水丸; 紫癜性肾炎; CD71受体
       紫癜性肾炎(Henoch-Sch nlein purpura nephropathy，HSPN)，是过敏性紫癜(HSP)的继发性肾脏损害，已成为儿童肾病的常见病因。其主要病理特点是IgA在系膜区沉积，但HSPN的发病机制仍未阐明。曾有研究认为，肾小球系膜区存在着介导IgA沉积和清除的多种受体。IgA系膜沉积和清除不平衡可能是系膜IgA沉积显著升高的直接原因[1]。目前研究认为，IgA主要清除途径是系膜细胞(MC)受体介导的IgA沉积物细胞内吞和分解代谢作用。有研究认为，人的 MC主要表达的IgA受体之一是转铁蛋白受体 (CD71) [2]。肾炎Ⅱ号水丸( ShenyanⅡ pill，SY)是以益气养阴、清热利湿、消瘀止血为主要功效的中成药，主要用于表现为以血尿为主的气阴两虚型的HSPN的患者。本方经多年应用，已取得了很好的临床疗效。本实验通过研究SY对HSPN模型小鼠系膜区CD71表达的影响，探讨SY治疗HSPN的机制。
       1 材料与仪器
       1.1 动物昆明种清洁级雌性小鼠140只，体质量23～27 g，黑龙江中医药大学实验动物中心提供，许可证号 SYXK(黑)2008001。黑龙江中医药大学实验动物中心提供普通饲料喂养。
       1.2 药品西咪替丁片(CI)，上海天平制药厂，沪卫药准字(1995)第011010号;双嘧达莫片(DI)，天津力生制药股份有限公司生产，国药准字H12020225;SY由黑龙江省中医研究院制剂室提供，批号为：黑药制字(2004)z第0012号。
       1.3 试剂麦胶蛋白(sigma公司产品，产品编号 CAS 9007-90-3);印度墨水(Ruibio公司产品，产品编号YI0719);考马斯亮蓝试剂盒(南京建成科技有限公司，批号20090413);肌酐试剂盒(长春汇力生物技术有限公司，批号20090407);FITC标记羊抗小鼠IgA抗体(Cessna Court公司，产品编号060411，0.5 mg);兔抗小鼠CD71抗体(Santa Cruz公司，产品编号sc-59112，200 μg·ml-1);FITC标记山羊抗兔IgG(Santa Cruz公司，产品编号sc2011，200 μg·0.5 ml-1)。
       1.4 仪器DHP-9082型电热恒温培养箱(上海一恒科技有限公司)，FZ UV-2102C型紫外-可见分光光度计(上海尤尼柯仪器有限公司)，SIGMA 3K30型低温离心机(德国SIGMA 公司)，E50i荧光显微镜(日本Nikon公司)，CM1850冷冻切片机(Leica公司)。
       2 方法
       2.1 动物分组140只雌性小鼠饲养一周后随机分组：空白组、模型组、SY高 (SYH)、中 (SYM)、低剂量组(SYL)、西药对照组(CI+DI) 、中西药合用组(SY+CI+DI)。
       2.2 HSPN模型制备口服麦胶蛋白+尾静脉注射印度墨水的方法[3]建立小鼠HSPN模型，方法如下：配制浓度为6 mmol·L-1 HCl的酸化饮用水及尾静脉注射印度墨水稀释液。实验开始的前3周尾静脉注射印度墨水，注射量为每次0.04 g·kg-1，每周1次，空白组注射生理盐水。3周后将麦胶蛋白加入酸化饮用水中，质量分数为0.1%，隔日灌胃，入量为每只0.5 ml，持续灌胃至14周末。空白组灌胃酸化饮用水14周之后，用0.01 mmol·L-1酸化水配制质量分数为0.01%的麦胶蛋白溶液，每只0.2 ml尾静脉注射，1次/d，连续3 d。空白组注射不含麦胶蛋白的酸化水。
       2.3 给药自造模第1天起进行灌胃给药。空白组和模型组灌胃生理盐水，每只0.2 ml;SYH、SYM、SYL组灌服SY，给药剂量分别为4.60 ，2.30 ，1.15 g·kg-1·d-1;CI+DI组灌服CI和DI，给药剂量分别为5.12×10-2 ，1.91×10-2 g·kg-1·d-1;SY+CI+DI组灌服CI，DI及SY，给药剂量分别为5.12×10-2 ，1.91×10-2 ，2.30 g·kg-1·d-1。
       2.4 尿蛋白(UPE)检测用细网代谢笼收集24 h尿液，取50 μl尿样。按考马斯亮蓝试剂盒说明书测定尿液中蛋白含量。
       2.5 血清肌酐(Scr)的测定摘眼球取血滴入1.5 ml离心管中，自然凝固1～3 h，凝成血块，用玻璃棒搅动后离心，3 000 r·min-1，10 min，取血清。按试剂盒说明书测定小鼠血清中Scr含量。
       2.6 SY对IgA沉积的影响新鲜冷冻肾组织标本行冰冻切片约8 μm，PBS液漂洗，加FITC标记羊抗小鼠IgA抗体(1∶50)，37℃孵育45 min，PBS液漂洗晾干后荧光镜检。
       2.7 SY对CD71表达的影响新鲜冷冻肾组织标本行冰冻切片约8 μm，PBS液漂洗，加兔抗小鼠CD71抗体(1∶100)，37℃孵育1 h，PSB液漂洗，加FITC标记山羊抗兔IgG(1∶25)，置于37℃孵育45 min，PBS液漂洗晾干后荧光镜检。
       2.8 统计学处理使用SPSS16.0统计软件，组间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)方法，方差齐性检验(homogeneity-of-variance)提示方差齐，用最小显著差法( least-significant difference，LSD)检验;方差不齐，用DunnettT3检验。计量资料以 ±s表示，P<0.05说明有显著性差异，P<0.01说明有非常显著性差异。计数资料组间比较用χ2检验。P<0.05说明有显著性差异，P<0.01说明有非常显著性差异。
       3 结果
       3.1 HSPN小鼠模型评价各组UPE结果见表1。在140只HSPN实验小鼠中，只有5只模型小鼠的血清Scr检测值超出了正常范围，为77.09～102.79 μmol·L-1，其中，4只在模型组中(占20%)，1只在SYL组(占5%)，其它各实验组小鼠的血清肌酐值在正常范围。模型组小鼠的UPE明显增加，与空白组相比有非常显著性差异(P<0.01)，说明模型建立成功。表1 SY对模型小鼠血清Scr及UPE的影响
       3.2 SY对IgA沉积的影响各组IgA沉积情况见表2及图1。与空白组比较，模型组小鼠肾小球系膜区IgA的沉积明显增强(P<0.01);与模型组比较，SYH、CI+DI组和SY+CI+DI组小鼠肾小球系膜区IgA的沉积明显减少(P<0.01)，SYM组肾小球系膜区IgA的沉积明显减少(P<0.05)。
       3.3 SY对CD71表达的影响各组CD71表达情况见表3及图2。与空白组比较，模型组小鼠肾小球MC的CD71表达明显降低 (P<0.01);SYH 、SYM 、SY+CI+DI组小鼠肾小球MC的 CD71表达皆明显升高(P<0.01)，SYL组小鼠肾小球MC的CD71表达明显升高(P<0.05);而CI+DI组与模型组比较无显著性差异(P>0.05)。图1 各组小鼠肾脏IgA沉积情况表2 SY对模型小鼠肾小球系膜区IgA免疫荧光的影响图2 各组小鼠肾脏CD71表达情况
       4 讨论
       有关HSPN的临床、病理及免疫学相关知识很多，而HSPN动物模型却鲜有文献报道。因为没有相应的实验动物模型，给HSPN的研究和新药开发带来了困难。由于HSPN和IgAN有着相似的免疫学特征和病理改变，抗麦胶蛋白IgA不单纯是IgA肾病的抗体，它也是HSPN的重要抗体。有学者认为两者可能是同一疾病的全身系统受累或肾脏单独受累两种不同表现[4]。本实验借鉴和参照了韩冰虹等[3]HSPN动物造模方法进行模型复制。与空白组比较，模型组UPE明显升高，IgA沉积明显增多，成功地建立了HSPN实验动物模型。表3 SY对模型小鼠肾小球MC的CD71表达的影响
       肾炎Ⅱ号水丸的药物组成是：黄芪、党参、生地、知母、白茅根、小蓟、侧柏叶、赤芍等。黄芪能明显减少尿中蛋白含量，有很强的免疫调节作用，可降低肾小球灌注压，保护肾功能[5]。另据《现代中药药理手册》报道：“黄芪对人体和动物均有明显利尿作用……明显改善肾衰竭动物的肾功能，使血肌酐下降，肾实质细胞代谢有明显改善”。白茅根[6]除具有止血、利尿作用外，还能提高机体免疫功能。川芎[7]的主要成分生物碱部分川芎嗪能抑制血小板聚集。坤草所含坤草碱具有明显的抗血小板聚集活性的作用，并能利尿。地榆[8]有抗炎、抗菌作用。本方中药的免疫调节作用协同其它中药的促进肾脏血液循环，保护肾脏、抗炎的作用，共同达到了治疗HSPN的效果。
       单纯的血清IgA升高不足以引发HSPN[9]。沉积在肾脏系膜区IgA及其免疫复合物，才会引发肾小球炎症反应。有研究表明，IgA在系膜区的沉积是可逆的[10]，这为研究者从根本上治疗HSPN提供了依据。IgA清除的主要清除途径是MC受体介导的IgA沉积物细胞内吞和分解代谢作用。离体试验也证明了MC能够完成受体介导的细胞内吞和分解代谢作用，这肯定了MC为系膜IgA清除起到了重要作用[11]。因此IgA与MC受体结合受损可能会导致IgA系膜清除不足，并会因此导致IgA蓄积，从而引发一系列肾脏病变。目前已经很清楚，人的 MC表达至少一种IgA受体[12]，即转铁蛋白受体 (CD71)，但IgA与其结合之后的效应并未明了。本实验研究了SY对HSPN系膜区CD71表达的影响。
       结果表明，与空白组比较，模型组CD71表达减少，其他各中药给药组系膜区CD71的表达均较模型组明显提高，与以往研究结果不同[13]。Moura等发现MC表达的CD71，是MC表面的IgA1主要受体，并且IgA肾病中肾小球细胞上的CD71持续地高表达，IgA可能由于CD71的过量表达而过度沉积。还有研究认为IgA和CD71是表达共位的[14]。本研究结果认为，IgA及其复合物通过其他途径沉积，而CD71可能是对IgA具有清除功能的受体。血清IgA水平升高并大量沉积的初期，IgA受体CD71表达下调，IgA清除严重不足，过多的IgA沉积在系膜区，使得系膜区原位补体激活，MC病变，调节整合素，影响MC-基质作用，使得系膜重塑，与此同时促进TGF-β1等细胞因子表达，导致系膜增生，CD71表达增多，与IgA结合进行清除，此时IgA和CD71是表达共位的，但IgA清除速度仍然比沉积速度慢，使病情进一步恶化。本实验所检测模型组CD71表达减少可能是初期受体下调时的结果。
       与模型组比较，SYH组和SYM组以及SY+CI+DI组模型小鼠UPE均明显降低，系膜区IgA沉积减少，CD71表达也相应的明显升高，说明SY可能通过使CD71表达升高来促进IgA清除，减轻免疫复合物引发的肾损伤，从而起到治疗效果。另一方面，似乎说明了IgA与MC上表达的CD71受体结合后的效应是CD71受体介导了IgA清除。
       本研究表明，SY可能通过促进HSPN患者MC上CD71受体的表达促进了系膜区对IgA的清除作用，从而抑制了IgA沉积后引发的MC病变，肾小球系膜增殖、肾小管间质损害和细胞外基质的积聚，减轻肾小球及小管间质的损害，延缓了HSPN的进展。
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