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       【关键词】  高效液相色谱
        摘要：目的建立附子中次乌头碱的含量测定方法。方法色谱柱为Hypersil ODS2，5 μm，4.6 mm×250 mm；流动相为0.2%冰醋酸(用三乙胺调pH 6.25)乙腈(63∶37)；流速：1.0 ml/min。结果次乌头碱在0.151～1.208 μg范围内线性关系良好，r=0.999 8，加样回收率为98.13%，RSD为1.14%。结论该法可作附子的质量控制指标之一。
        关键词：附子；  次乌头碱；  高效液相色谱法
        附子为毛莨科植物乌头Aconitum carmichaeli Debx.子根的加工品，依炮制方法不同有盐附片、黑顺片、白附片等饮片规格。《中国药典》2000版Ⅰ部附子项下未收载含量测定方法。附子中含双酯型生物碱，主要有乌头碱、次乌头碱和新乌头碱等。文献报道酯型生物碱含量测定有酸性染料比色法［1～2］、高效液相色谱法(HPLC)［3～5］和薄层扫描法［6］。本文采用HPLC对附子中酯型生物碱进行分析，经预试验附子中乌头碱的含量极低或未能检出，新乌头碱的含量也很低，，次乌头碱的量最大，而且次乌头碱是酯型生物碱毒性显著降低的水解产物，故以次乌头碱的含量作为定量指标，作为附子质量控制指标之一。
           1  仪器与材料
        1.1  仪器高效液相色谱仪(HP1050)；色谱柱：Hypersil ODS2，5 μm,4.6 mm×250 mm。
        1.2  材料附子(购自广东省药材公司中药饮片厂、广州市药材公司经营)，次乌头碱(购自中国药品生物制品检定所)，乙腈为色谱纯，其他试剂为分析纯。
           2  方法与结果
        2.1  色谱条件确定
        2.1.1  检测波长的选择次乌头碱的甲醇溶液分别进行紫外扫描，结果均在235 nm处有最大吸收，与文献报道［3］的测定波长一致，故采用235 mm作为检测波长。
        2.1.2  流动相的选择文献［4～5］报道的流动相碱性过强或加入氯仿。本文实验0.2%冰醋酸(用三乙胺调pH 6.25)乙腈(63∶37)作为流动相，次乌头碱能与其它成分达到较好分离效果。结果见图1～2。
        图1  次乌头碱HPLC图谱
        2.1.3  流速及柱温的选择参考文献采用常用的流速1.0 ml/min；柱温为室温。
        2.2  对照品溶液的制备精密称取次乌头碱适量，用甲醇溶解并分别配制成0.037 7 mg/ml的对照品溶液。
        2.3  供试品溶液的制备精密称取本细粉约5 g的量，置具塞锥形瓶中，加入乙醚氯仿(3∶1)的混合溶液50 ml和氨试液4 ml，摇匀，放置过夜，滤过，药渣加混合溶液50 ml，连续振摇1 h，滤过，药渣再用上述混合溶液洗涤3～4次，15 ml/次，滤过，合并滤液与洗液，蒸干。残渣加混合溶液5 ml使溶解，转移至分液漏斗中，用0.05 mol/ml的硫酸溶液提取4次，10 ml/次。合并硫酸液，加浓氨试液调pH值9～10，摇匀，用氯仿提取4次，10 ml/次。合并氯液，蒸干，残渣加甲醇溶解并定容至5 ml。
        图2  附子的HPLC图谱
        2.4  线性关系考察分别精密吸取次乌头碱对照品溶液(0.075 5 mg/ml)各0.5，1，2，3，4，5 ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，得系列浓度的对照品溶液。精密吸取系列浓度的对照品溶液20 μl，按上述色谱条件测定峰面积，以进样量(μg)为横坐标，以峰面积(A)为纵坐标，得次乌头碱的回归方程为Y=1 357.411X 4.622，r=0.999 8，表明次乌头碱在0.151～1.208 μg范围内线性关系良好。
        2.5  仪器精密度实验精密吸取上述乌头碱对照品溶液各20 μl，重复进样5次测定峰 面积，结果峰面积平均值为1 017.959，RSD为1.76%，表示仪器精密度良好。
        2.6  稳定性实验精密吸取同一批供试品溶液各20 μl，分别在0，4，8，12，16h进样，按上述色谱条件测定峰面积，结果峰面积的平均值为472.966，RSD为1.68%，表明供试品溶液在16 h内基本稳定。
        2.7  重现性实验取同一批的样品5份，按含量测定项下方法平行试验，结果样品含量为0.017 5 mg/g，RSD为2.12%，表明方法具有良好的重现性。
        2.8  加样回收率实验取已知含量的样约2.5 g，精密称定，精密加入一定量的次乌头碱对照品，平行操作5份，按供试品溶液的制备与测定同法操作。结果见表1。
        表1  加样回收率实验结果样品（略）
            
    2.9  样品的测定分别精密吸取上述次乌头碱对照品溶液及供试品溶液各20 μl，注入液相色谱仪中，测定峰面积，按外标法计算含量。结果见表2。
        表2  样品含量测定结果样品  （略）
       3  讨论
        3.1  供试品溶液制备的提取溶媒是参考《中国药典》2000年版Ⅰ部“川乌”项下的乙醚氯仿(3∶1)。文献［4，5］报道的流动相多碱性过强或加入氯仿。本文实验参考文献［3］报道的流动相。经实验0.2%冰醋酸(用三乙胺调pH6.25)乙腈(63∶37)时，次乌头碱能与其客它成分达到较好分离效果。
        3.2  生附子中含有毒性很大的乌头碱，临床上使用的附子多为炮制品，炮制目的是使乌头碱水解，成为毒性较小的次乌头碱和新乌头碱。经试验附子中乌头碱的量极低或未能检出，新乌头碱的量也很低，次乌头碱的量最大，与文献［4］报道的结果基本一致。
           参考文献：
       ［1］  李云霞.酸性染料比色法测定川草乌头生物碱的含量［J］.中成药,2000,22(9):662.
［2］  汪海孙.风湿骨痛丸中乌头总生物碱的含量测定［J］.中成药,1988,10(4):14.
［3］  黄建明.草乌中生物碱含量测定方法的研究［J］.中药材,2002,25(12):878.
［4］  王慕邹.炮制附子中生物碱含量的变化［J］.中草药,1983,14(1):1.
［5］  谭炳炎.液相色谱法测定保心胶囊中次乌头碱的含量［J］.中药材,2001,24(1):52.
［6］  王浴铭.活血壮筋丹中乌头碱含量的双波长薄层扫描法测定［J］.中成药研究,1988,10(1):13.
        (广东省人民医院，广东 广州  510080)