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       【关键词】  隔山消
        摘要：目的探讨隔山消对药物所致小鼠空间学习记忆障碍的作用，并初步探讨其作用机理。方法50只昆明小鼠随机平均分为空白对照组、模型组、阳性对照组(刺五加注射液)、隔山消高、低剂量组，各组动物在作相应的处理之后，于Morris水迷宫实验中测试其潜伏期。各组动物完成行为实验后颈椎脱臼处死。在低温下取其脑组织，用羟胺比色法测定脑组织中Ach含量和Ach-E的活性。结果模型组动物达岸时间(即潜伏期)明显延长，表明空间学习记忆产生障碍；阳性对照组，隔山消高、低剂量组潜伏期均明显低于模型组，且第3天成绩好于空白对照组。三者相互比较，隔山消高剂量组第3天成绩最好。隔山消高，低剂量组的Ach含量明显高于模型组，而隔山消高低剂量组的AchE活性均略高于模型组，且均低于阳性对照组。结论隔山消对于药物所致的空间学习记忆障碍有一定的作用。
        关键词：隔山消；  空间记忆障碍；  Morris水迷宫实验；  小鼠
        The Effects of Cynachum uilfordii (Maxim) Hemsl on the Learning Memory Disorder Caused by Drug in Mouse
        XU Ying,ZUO Ke, GAN Man, LU Hong, GUO Lianjun*
        (Tongji Medical College of Huazhong University of Science & Technology, Wuhan 430022, China)
        Abstract:ObjectiveTo investigate the effects of Cynachum uilfordii (Maxim) Hemsl on the mouse space learning memory disorder caused by drug and to investigate the mechanism of effection.Methods50 mouse were randomly divided into blank matched group,model group,positive control group(manyprickle acanthopanax root injection),Cynachum uilfordii high dosage group(15 g/kg) and low dosage group (7.5 g/kg).Each group was deal with severally,then measured the latent periods in Morris Water Maze test.The mouse of each group were put to death by dislocating their cervical vertebras after the behavior tests.The brain was hydroxylamine colorimetric method.ResultsThe reachingbank time (latent period)of model group prolonged obviously,which showed the space learing memory disorder;The latent periods of positive control group,Cynachum uilfordii high dosage group and low dosage group prolonged control group,Cynachum uilfordii high dosage group was the best of the three above.The content of Ach of Cynachum uilfordii high dosage group and low dosage group was visibly high dosage group and low dosage group were appreciably higher than that of model group,and both of them were lower than of positive control group.ConclusionThe results indicated the Cynachum uilfordii(Maxim)Hemsl has effect on the space learing memory disorder caused by drug.
        Key words:Cynachum uilfordii(Maxim) Hemsl;   Learning memory disorder;   Morris Water Maze test;   Mouse
        学习记忆属高级神经活动。学习和记忆的基本过程大致可分为三个阶段：获得，巩固和再现。了解学习记忆过程，提高学习记忆能力，无疑是当今社会一个值得关注的课题。根据学习记忆的生理生化基础，目前多选用一些化学药品致记忆损伤。从而复制出学习记忆障碍模型，以研究各种药物对某些药物所致的学习记忆障碍方面的改善作用。近年来，我国传统的中药越来越受到重视，中药在许多疾病的治疗上，显示出的优越性是许多西药所不及的。隔山消Cynachum uilfordii(Maxim)Hemsl又名白首乌，是祖国传统中药，具有养血益肝，固肾益精，乌须黑发和延年益寿的功效。现在研究发现白首乌中含有多种有效成分，具有抗肿瘤，抗衰老等多方面的药理活性，其主要成分为羟基马甾烷酯苷，其中富含磷脂类成分，可以抗肿瘤抗衰老，而且对脑细胞具有保护作用。据此设计本实验，研究隔山消对药物所致小鼠学习记忆障碍的影响，并测定其大脑中Ach含量和Ach-E活性的改变，以初步探讨其可能的作用机理。
           1  材料和方法
        1.1  材料
        1.1.1  动物与药品选用成年健康的昆明种小鼠，雌雄各半，体重20～30 g，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。隔山消，中药原材料，购自湖北省中药材公司，由湖北中医学院药学部进行加工粉粹过筛120目，实验时取7 g粉末，加入45 g纯净水，文火加热至沸腾，静置10 min后，过滤两次取其过滤液。4℃保存，灌胃前适当加温。刺五加注射液(有效成分黄酮5 mg/ml，批号ZZ5397黑卫药准字(1990)第200416号)，黑龙江乌苏里江制药有限公司。戊巴比妥钠粉剂，上海试剂分购度试剂厂，批号：860603，用蒸馏水配置成1.5%溶液，供腹腔注射。溴化乙酰胆碱，其他试剂均为市售分析纯或化学纯。
        1.1.2  仪器Morris水迷宫系统：水桶直径76 cm，桶高36 cm，水深12.9 cm，安全岛高：11.4 cm，计算机软件系统：泰盟Bio2000实验系统；摄像机；SONY；台式高速冷冻离心机TL16R(上海离心机研究所)；722型分光光度计；上海申化仪表自控公司产品。
        1.2  方法
        1.2.1  动物分组与模型的建立将50只小鼠随机分为5组，每组10只，①空白对照组：不给予任何药物，于每次训练前1 h灌胃(NS，0.5 ml/20 g)②模型组：于实验前3 d开始每天腹腔注射戊巴比妥钠1次(剂量：1.5 mg/ml,0.1 ml/10 g体重)。开始实验后，每次训练前30 min戊巴比妥钠腹腔注射(剂量同上)③阳性对照组：于实验前6 d开始每天腹腔注射1次刺五加注射液(剂量：1.5 mg/ml,0.1 ml/10 g体重)。开始实验后于训练前1 h腹腔注射剌五加注射液，剂量同上。④隔山消低、高剂量组：实验开始前6 d开始每天灌胃(隔山消，7.5，15 g/kg)实验开始后每天提前1 h灌胃。其中，阳性对照组，隔山消低、高剂量组在实验开始后，于每天训练前30 min腹腔注射戊巴比妥钠1次(剂量：1.5 mg/ml,0.1 ml/10 g体重)。
        1.2.2  行为学实验方法用过圆心的两条相互垂直线分水迷宫为A，B，C，D  4个象限，安全岛位于A象限，位置固定。每天将小鼠依次从B，C，D区面朝桶壁放入水迷宫中，记录其自下水到抵达并停留在安全岛(A区)上所用的时间，即潜伏期。以120 s为限，若此时间内动物不能到达安全岛，在将此小鼠安置于安全岛上10 s，让其熟悉环境。
        1.2.3  Ach含量和Ach-E活性测定实验结束后，于冰台上以颈椎脱臼法处死，并迅速取出全脑，去其脑干及小脑，用水生理盐漂洗，滤纸吸干后称重，样品以冰生理盐水配制成20%匀浆液，4℃ 4 500 r/min离心5 min，取其上清液，按羟胺比色法进行Ach含量，Ach-E活性测定。
        1.3  统计学处理实验数据用±s表示，各组间差异用t检验进行统计学分析。
           2  结果
        2.1  隔山消对戊巴比妥钠所致小鼠学习记忆障碍的影响连续3 d的水迷宫试验发现，模型组的潜伏期成绩明显延长，说明模型复制成功。阳性对照组第3天的潜伏期明显缩短，与模型组比较(P＜0.05)；隔山消高剂量组第3天的潜伏期与模型组比较(P＜0.01)；隔山消低剂量组第3天的潜伏期与模型组比较(P＜0.05)。结果见表1，图1。
        表1  隔山消对戊巴比妥钠所致小鼠学习记忆障碍的影响(略)
        图1  隔山消对戊巴比妥钠所致小鼠学习记忆障碍的影响
        2.2  隔山消对小鼠脑组织Ach含量，Ach－E活性的影响在低温下取小鼠脑组织匀浆，用羟胺比色法测定各组小鼠脑组织中Ach含量及AchE活性，其结果显示：隔山消高，低剂量组小鼠脑组织中的Ach含量明显高于模型组小鼠脑组织中的Ach含量(P≤0.01)，隔山消高，低剂量组小鼠脑组织中的AchE活性均高于模型组。结果见表2，图2～3。
        表2  隔山消对戊巴比妥钠所致学习记忆障碍（略）
           3  讨论
        隔山消，又名白首乌，是传统补肾良药，具有养血益肝，固肾益精，乌须黑发和延年益寿的功效。经研究发现该中药含有多种有效成分，具有抗肿瘤，抗衰老等多方面的药理活性，其主要成分为羟基马甾烷酯苷，其中富含磷脂类成分，可以抗肿瘤抗衰老，而且对脑细胞具有保护作用。中医认为“肾藏精，精生髓，通于脑”，“脑为髓海”，故脑功能与肾精盛衰密切相关。补肾可益精生髓，健脑促智，中医药临床上运用补肾法延缓衰老，防止脑功能减退有悠久历史。而用隔山消对抗药物引起的空间学习记忆障碍尚未见报道。
        图2  隔山消对戊巴比妥钠所致学习记忆障碍小鼠脑组织Ach含量的影响
        图3  隔山消对戊巴比妥钠所致学习记忆障碍
        小鼠脑组织AchE活性的影响本实验从动物行为学实验和生化测定实验两方面探讨隔山消在对抗药物引起的空间记忆障碍的作用。先用药物造成小鼠空间学习记忆障碍，即制作动物一种记忆障碍的模型，采用水迷宫实验方法，观察药物对动物行为功能的影响，同时用生化测定方法，初步分析药物作用机制。为获得稳定可靠的模型，需注意以下问题：实验环境对实验结果有非常大的影响。本实验宜在隔音或半隔音室内进行，同内温度，湿度光照度应适宜并保持一致。实验室内物品摆放及实验人员在实验中所处的位置保持一致。本实验观察到上午与下午进行的测试会有所差别，可能与上、下午小鼠分泌的激素或神经甾体的量有关。光线的强弱、室内物品的摆放，和实验人员站位对小鼠测试也有较大影响。小鼠在一定的空间、光线下训练，经条件反射形成记忆，改变上述实验条件，会影响条件反射的形成，从而使实验结果有较大差异。通过水迷宫实验发现，阳性对照组(刺五加组)和隔山消组(高、低剂量组)对小鼠寻找平台的潜伏期均明显小于模型组。结果显示，隔山消对药物所致的空间学习记忆障碍，有明显改善作用。Ach是脑内的经典神经递质，与认识、学习、记忆等大脑高级神经功能有关。学习记忆任务的完成伴随着脑内的Ach的变化。AchE是Ach的分解酶，它的活力变化可间接反映脑内Ach含量的关系。本实验采用羟胺比色法测定脑组织乙酰胆碱和胆碱酯酶的含量，结果提示，模型组小鼠脑组织中Ach含量和Ach-E活性均低于正常对照组和给药组鼠，隔山消组小鼠脑组织中Ach含量及AchE活性明显高于模型组。表明隔山消对戊巴比妥钠所致的小鼠学习记忆障碍的改善可能与影响中枢胆碱能系统功能有一定关系。大脑的空间学习记忆能力涉及到多种机制参与，而不是单一的胆碱能系统来发挥作用的，因此有关其他作用机理有待进一步研究。
           参考文献：
        ［1］  Melchart D,Linde K.Weklenhammer W,Hager S,et al.Liver enzyme elevations in patients treated with traditional Chinese medicine［J］.JAMA 1999,282:28.
        ［2］  杨胜平,任建军,王道周,等.土家族药“隔山消”对乙肝病毒携带者的疗效［J］.中国民族民间医药杂志,1995,4(2):33.
        ［3］  徐叔云,卞如镰,陈  修.药理实验方法学，第2版［M］.北京:人民卫生出版社,1994:660.
        (华中科技大学同济医学院基础医学院，湖北 武汉  430022)