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       【摘要】 
       目的建立反相高效液相色谱（RPHPLC）法测定解痉镇痛酊中橙皮苷含量的方法。方法采用C18柱，甲醇：1%醋酸溶液（40∶60）为流动相，流速为1.0 ml·min-1，检测波长为283 nm，柱温为35℃。结果橙皮苷在0.102～0.765 μg范围内线性良好，r=0.999 6；平均加样回收率为97.7%，RSD为1.38%(n=5)。结论 该方法快速简便，准确可靠，灵敏度高，可用于解痉镇痛酊的质量控制。
       【关键词】  解痉镇痛酊； 橙皮苷； 反相高效液相色谱法
       
       Determination of Hesperidin in Jiejing Zhentong Tincture by RPHPLC
       JIN Yang
       Anhui Wuhu Institute for Drug Control of Anhui ,Wuhu 241000,China
       Abstract：ObjectiveTo establish the determination method of hesperidin in Jiejing Zhentong Tincture by RPHPLC.MethodsThe separation was performed on C18 column, with methanol1%acetic acid(40∶60) as mobile phase. The flow rate was 1.0 ml·min-1, the detection wavelength was at 283 nm, and the column temperature was 35℃. ResultsThe linear range of hesperidin was in the range of 0.102～0.765 μg,r=0.999 6.The average recovery was 97.7%,and RSD was 1.38%(n=5).ConclusionThis method is rapid,sensitive and accurate,and it can be used for quality control of Jiejing Zhentong Tincture.
       Key words：Jiejing Zhentong tincture；  Hesperidin；  RPHPLC
        解痉镇痛酊由辣椒浸出液、陈皮浸出液、水杨酸甲酯、薄荷脑等4味药组成，有活血通经、止痛的功效，用于治疗软组织损伤而引起的颈、肩、腰、腿痛；对冻疮也有一定的疗效。该药收载于国家药品标准［1］中，但该标准只有一个化学鉴别与乙醇量的测定，没有含量测定项。为了更好地控制产品质量，在大量实验的基础上，采用RPHPLC法对主药陈皮中的橙皮苷进行了含量测定，结果证明该方法是可行的，能有效地控制该药的质量。
       1  仪器与试药
        Agilent 1100高效液相色谱仪（DEGASSER，IsoPump，ALS，COLCOM， VWD，DAD，Chemstation for LC 3D）；色谱柱：AgilentODS3(5 μm ，4.6 mm×250 mm），梅特勒托利多AB265S电子天平。
        橙皮苷对照品（批号：110721200211，供含量测定用，中国药品生物制品检定所），除甲醇为色谱纯、水为纯化水外，其它试剂均为分析纯，解痉镇痛酊为市售品（由上海市某一制药企业生产，批号050205，050613，051103 ）。
       2  方法与结果
       2.1  测定波长的选择 
       根据文献报道［2］，本实验应选择283 nm作为检测波长，经Agilent 1100的DAD检测器扫描测定，橙皮苷在283 nm处有最大吸收，可以作为橙皮苷的检测波长。
       2.2  色谱条件 
       AgilentODS3色谱柱(5 μm ，4.6 mm×250 mm)，流动相为甲醇：1%醋酸溶液（40∶60），柱温为35℃，检测波长为283 nm，流速1.0 ml·min-1。
       2.3  对照品溶液的制备精密称取对照品适量，加甲醇配制成每毫升含橙皮苷0.051 mg的溶液即得。
       2.4  供试品溶液的制备精密吸取解痉镇痛酊25 ml，水浴蒸去乙醇，残渣加入硅藻土适量，拌匀，置入索氏提取器中，加入石油醚（60～90℃）适量，加热回流2～3 h，弃去石油醚液，药渣挥干，加甲醇适量，再加热回流至提取液无色为止，放冷，提取液置100 ml量瓶中，用少量甲醇分次洗涤容器，并入同一量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。
       2.5  阴性对照溶液的制备按缺陈皮浸出液的处方进行配制，然后同供试品溶液的制备方法进行制备即得。
       2.6  系统适应性实验分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液10 μl注入液相色谱仪，按上述色谱条件进行分析，记录色谱图，发现该色谱条件下柱效较高，橙皮苷与其它组分可完全分离，阴性对照溶液图谱在橙皮苷峰位置处无假阳性峰。见图1～3。
       2.7  线性关系考察精密吸取2，4，6，8，10，15 μl橙皮苷对照品溶液，注入液相色谱仪，按上述色谱条件分别测定其峰积，以橙皮苷的量X（μg）为横坐标，测得的峰面积Y为纵坐标，进行线性回归，其回归方程为：Y=3.991×103X+1.842×101,r=0.999 6（n=6），结果表明橙皮苷在0.102～0.765 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。
       2.8  精密度实验精密吸取上述对照品溶液10 μl重复进样5次，按上述色谱条件测定橙皮苷峰面积。结果：RSD=0.85%(n=5)，表明进样精密度良好。
       2.9  稳定性实验取“2.4”项下供试品溶液，重复进样1次/h，10 μl/次，持续6 h，其峰面积的RSD=1.05%(n=6)，结果表明供试品溶液6 h内基本稳定。
       2.10  重复性实验取同一批号的解痉镇痛酊，按“2.4”项下的方法进行制备，并按上述色谱条件重复测定5次，测得橙皮苷的平均含量为1.26 mg·ml-1， RSD=1.25%(n=5),表明分析方法精密度较好。
       
       2.11  回收率实验采用加样回收法，分别精密吸取已知橙皮苷含量的样品1 ml，共5份，再分别精密加入一定量的橙皮苷对照品，按“2.4”项下的方法进行处理，并按上述色谱条件测定，计算回收率。结果见表1。表1  回收率实验结果 （略）
       2.12  样品含量测定精密吸取不同批号的样品25 ml按“2.4”项下的方法进行制备，再精密吸取对照品溶液与样品溶液各10 μl，注入液相色谱仪中，按上述色谱条件测定，以外标法测定样品中的橙皮苷的含量。结果见表2。表2  3批样品中橙皮苷的含量（略）
       3  讨论
       3.1  本品经二极管阵列检测器扫描测定，橙皮苷在283 nm处有最大吸收，与《中国药典》［2］报道的一致，本实验也选择283 nm为检测波长，保证了检测的准确性。
       3.2  在该实验中曾考虑不经过去乙醇和石油醚处理，而直接把供试品注入液相色谱仪中，结果发现杂质峰很多，而且跟橙皮苷不能很好的分离，本样品经过上述方法处理后，不仅减少了样品对色谱柱的污染，而且大大减少了杂质峰，确保了橙皮苷峰与杂质峰的良好分离，同时提高了柱效。
       3.3  在该实验中曾选用甲醇-醋酸-水［2］、甲醇-水［3］系统作为流动相，均发现柱效不高，而且拖尾较严重。结果表明，以甲醇：1% 醋酸（40∶60）为流动相，再适当提高柱温就能解决上述问题，而且保留时间较短。
        
       【参考文献】
         　　［1］国家药典委员会，中国药典，药品标准·中药成方制剂，第17册［S］.1998：270.
       
       ［2］国家药典委员会，中国药典,Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社，2005：132.
       
       ［3］刘志红,马德平,朱瑞龙.HPLC测定乳痛消Ⅱ号中橙皮苷的含量［J］.中成药，2003，25(3)：244.