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       【摘要】 
       目的制备高纯度芦丁的目的是用作对照品或满足其它特殊需要的试剂。方法从槐米中提取芦丁，并将其制备成对照品。采用既简便又经济的酸提碱沉法从槐米中提取芦丁，经过精致，分离得芦丁对照品，并用一般方法、薄层层析法、核磁共振法进行鉴定，高效液相法测定其含量。结果经化学法、薄层层析法鉴定，核磁共振鉴定表明芦丁样品与芦丁标准品图基本一致；高效液相测得含量98.05%。结论 此种实验室制备芦丁对照品的方法操作简单易行，产品纯度较高可作为对照品代替标准品用。
       【关键词】  芦丁；分离；纯化；高效液相色谱法；含量测定
       
       The Purification and Determination of Rutin
       ZHAO Wenbin，XU Yuhua ， WANG Lushi, MO Mingdong
       Key Laboratory of Phytomedicine Resources & Modernization of TCM, Xinjiang Military Construction Group, Shihezi, Xingjiang 832002，China
       Abstract：ObjectiveTo establish the methods for purification, identification and determination of rutin reference substance.Methods Extract rutin from Sophora japonica L. by the alkali extraction and acid precipitation. Then refinement and separation of the rutin reference substance was done. Identified the substance by the normal way. TLC and NMR . HPLC was used to determine the content of rutin. Results After identified by chemical way, TLC, and NMR, the results showed that the chart of the sample of rutin and the chart of standard substance were unanimous, the mean content was 98.05%.ConclusionThis way of preparing rutin in the lab is simple and practical. The products are very pure, so it can be used in place of substance replaced standard substance.
       Key words：Rutin;  Separation ;  Purify ；   HPLC；  Determination
        芦丁是一种分布广泛的黄酮类化合物，主要存在于槐米，芸香，荞麦，沙棘等植物。黄酮类化合物在心脑血管疾病的治疗上起到了举足轻重的作用，芦丁［utin,又称芸香苷(rutnoside)］便是其中的一个典型代表，其效用同维生素P。能降低毛细血管通透性和脆性，促进细胞增生和防止血细胞凝聚以及抗炎、抗过敏、利尿、解痉、镇咳，降血脂等方面的作用［1］，临床上芦丁主要用于高血压病的辅助治疗和用于防治因芦丁缺乏所致的其它出血症，如防治脑血管出血、高血压、视网膜出血、紫癜、急性出血性肾炎、慢性气管炎，血液渗透压不正常恢复毛细血管弹性等症，同时还用于预防和治疗糖尿病及合并高血脂症［2］，国内外医药工业中用芦丁作原料生产芦丁片、维脑路通(羟乙芦丁)、芦丁镁、槲皮素等心血管药物［3］。芸香苷广泛应用于医药，保健食品和化妆品中。在食品工业中芦丁除了可作保健品外，还可作为抗氧剂和天然食用黄色素。在化妆品行业，芦丁是目前较为理想的一种天然广谱防晒剂［4］，本实验拟探究一种实验室制备高纯度芦丁的方法，用作对照品或满足其他特殊需要的试剂。
       1  仪器与试剂
       1.1  仪器
       高效液相(Waters)，电子分析天平(型号BS124S)，JB202-电热恒温干燥箱(上海金忠科学仪器有限公司制造)，DL-360超声波清洗皿(浙江象山县石浦海天电子仪器厂)，TGL-16台式高速离心机(上海冠戈实业有限公司制造)，紫外分光光度计（2401PC-日本岛津）。
       1.2  试剂芦丁标准品(中国药品生物制品鉴定所)，甲醇为色谱醇，其它试剂均为分析醇，水为重蒸水。
       1.3  材料购于石河子大学一附院药房经鉴定无误。
       2  方法与结果
       2.1  芦丁的提取精制采用酸提碱沉法，称取槐米粉，置500ml烧杯中，加沸水、硼砂搅拌，于石棉网上加热至微沸，然后加入适量饱和石灰水溶液，保持pH8～9之间，并不断地搅拌，微沸30min后，过滤，滤液收集，滤渣在置于500 ml烧杯中，加沸水ml，硼砂搅拌，于石棉网上加热至微沸，然后在加入适量饱和石灰水溶液，调pH 8～9之间，并不断的搅拌，微沸30 min后，过滤，滤渣弃去，滤液合并，待滤液温度降至60～70℃之间时用浓盐酸调pH 4～5之间，当温度降至室温时放入冰箱静置12 h，使沉淀完全，抽滤，沉淀用蒸馏水洗至中性，干燥得粗品芦丁，蒸馏水重结晶，得精制芦丁。
       2.2 芦丁的纯化用葡聚糖凝胶柱进一步分离纯化，称取精制芦丁0.25 g，用少量甲醇使之溶解，加入葡聚糖凝胶柱顶，用甲醇洗脱，试管收集，15 ml/管，共收集22管，用聚酰胺膜鉴定芦丁并作如下合并收集液。第1瓶1～10管，第2瓶11～22管；然后水浴浓缩至原液的一半，冷置，仅第一瓶出现黄绿色微细针状结晶，再继续浓缩，60℃干燥即得芦丁纯品。
       2.3   芦丁的鉴定
       2.3.1  一般鉴定 
       本品为黄色结晶粉末，熔点经梯勒熔点管测定熔程为188～190℃，与文献报道一致；盐酸镁粉反应呈阳性；氨性氯化锶反应呈阳性显示有邻二酚羟基；锆盐枸橼酸反应呈阳性显示有3及5-羟基存在。水解液用薄层层析鉴定，显示有葡萄糖及鼠李糖存在。
       2.3.2  薄层层析鉴别纯度 
       用3 cm×5 cm的聚酰胺膜，选3种展开剂：分别为A，丙酮∶水（3∶1）；B，氯仿∶甲醇（5∶4）；C，醋酸乙酯∶甲酸∶水（8∶1∶1）。氨熏后喷显色剂3%的三氯化铝显色，经重结晶的芦丁样品在上述3种展开剂中均显两个斑点，Rf值较低的点与槲皮素标准品的Rf值相等，因此证明芦丁中含有少量槲皮素。继续用葡聚糖凝胶分离纯化，结果芦丁在上述3种展开剂中， 只显一个斑点。结果见图1。
       2.3.3  氢核磁共振法鉴定
       由图可表明芦丁样品与芦丁标准品图一致，结果见图2。
       2.4  芦丁含量测定(HPLC法)
       2.4.1  色谱条件  
       流动相为甲醇4.3%乙酸(55∶45)，应用前经混合纤维素酯微孔滤膜过滤，超声脱气，流速为1.0 ml/min，进样量为20 μl，检测波长为254 nm，芦丁的出峰时间为3 ～4 min，该色谱条件下对照品及样品的色谱图结果见图3～4。
       2.4.2  最大波长的选择配置芦丁标准品溶液，浓度为0.002 04 mg/ml在紫外分光光度计中扫描得如下图：结果显示最大吸收波长有214，254，360 nm，由于在214 nm处干扰因素多，因此高效液相选择在254 nm处测定。结果见图3。
       2.4.3  供试品溶液的配制精密称取经变色硅胶干燥的芦丁标准品0.01005 g，芦丁样品1号(为经过葡聚糖凝胶柱分离的)0.010 05 g，芦丁样品2号(未经葡聚糖凝胶柱分离的)0.010 02 g，分别置于50 ml容量瓶内，用甲醇定容，在超声清洗皿中超声3 min，使之全部溶解，然后在分别倒少量入EP管中离心10 min，12000 r/min。得芦丁标准品溶液浓度为0.201 mg/ml，芦样1号浓度为0.201 mg/ml，芦样2号浓度为0.2004 mg/ml。
       2.4.4  标准曲线的制备 
       芦丁标准品溶液的浓度为0.201mg/ml，将其稀释成1，1/2，1/4，1/16，1/64，1/256系列浓度，编号为1，2，3，4，5，6，吸取20 μl进样，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线如下，进行线性回归处理，求出回归方程：Y=4E+07X-2 660.2，r=0.999 6，浓度单位是mg/ml，峰面积的范围在228 710.5 μV·s～7 494  036.5 μV·s内，结果表明芦丁的在0.006 281 25～0.201 mg/ml浓度范围内，浓度与峰面积呈良好的线性关系。结果见图6。
       2.4.5  样品含量测定［5］
       将配制好的芦丁样品1号，2号进样，测得峰面积，然后代入标准曲线得浓度。结果见表1～2。表1  样品1号含量测定结果（略）表2  样品2号含量测定结果（略）
       2.4.6  加样回收实验 
        
       分别取3份已知浓度的样品1号溶液0.8ml放入EP管中，在分别加标准品溶液0.1，0.2，0.3 ml，甲醇0.2，0.1，0 ml，定于1.1 ml，离心10 min，12000 r/min，结果见表3。表3  回收率测定结果（略）
       2.4.7  芦丁样品精密度实验   
       精密量取芦丁样品1号溶液1 ml放入EP管中，离心10 min，12 000 r/min。共测5次。结果见表4。表4  精密度实验结果（略）
       2.4.8  芦丁样品重现性实验   精密量取芦丁样品1号溶液0.8 ml于EP管中，在加0.2 ml甲醇，分别做5份，离心10 min，12 000 r/min。结果见表5。表5  样品重现性实验结果（略）
       3  讨论
       3.1  用酸提碱沉法提取芦丁具有工艺简单、效率高和较经济等优点，采用高效液相法测定芦丁的含量，该法使用的试剂常见，方法精确、灵敏、线性范围宽，稳定性和重现性均能满足要求。测得芦丁的含量为98.05%，可以代替对照品测定物质的含量和满足其它特殊需要的试剂。
       3.2  在芦丁的提取工艺中，由于用的是酸提碱沉法，所以加入的石灰水的量和浓盐酸的量是本试验的关键，当pH为10时，产品质量为1.5 g，当pH为9时，产品质量为2.3 g，当pH为8时，产品质量为1.97 g，当pH为7时，产品质量为1.10 g。
       3.3  经鉴定精致的芦丁中含有少量槲皮素，再用葡聚糖凝胶柱进一步纯化。葡聚糖凝胶对分离黄酮类化合物效果很好，此方法即简便，又适合实验室操作。实验产品纯度高，含量达98.05%，可代替芦丁标准品测定芦丁制剂中的芦丁含量。
       3.4  实验中笔者发现芦丁极易被氧化变色，要注意避光干燥保存。
       3.5  选择沸水溶液提取以破坏酶，而且在槐米中果胶和黏液质较多。提取液通常因含有大量黏稠的杂质而难以过滤，所以本文直接用水加石灰乳提取芦丁，方法更加有效，但应注意加硼砂以保护临二酚羟基，而且整个过程对酸度控制要求较高。
       3.6  柱温对含量测定的影响较小，随着柱温的增加，保留时间有所缩短，峰的扩散有所改善，但对含量测定影响较小。
        
       【参考文献】
         　　［1］Patrizo,R.Oetti,et al.,Prevention of Diabetes of Increased Aging Effect on RatCollagen-IinredFluoreescence by Aminoguanidne and Rudin［J］. Diabetes,1990,37：7961.
       
       ［2］杨德全，叶建阳，刘鸿云，等.从苦荞麦中提取芦丁的研究［J］.延安大学学报(自然科学版)，1997,16(4)：67.
       
       ［3］何铭清.中草药有效成分理化与药理特性［M］.长沙湖南科学技术出版社,1979：2031.
       
       ［4］宋延生. 天然防晒剂－芦丁［J］.日用化学工业杂志，1991，5：47.
       
       ［5］刘林喆，孙曾培. 苦荞麦疗效粉中芦丁的含量测定［J］.药物分析杂志，1991，11（1）：49.