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       【摘要】 
       目的对飞蓬中总黄酮有效部位进行研究，并以此为依据开发中药五类新药。方法以总黄酮和灯盏乙素提取率为评价指标，选取不同提取溶剂和提取方法，利用正交实验L9（34）优选乙醇回流提取飞蓬的工艺。结果飞蓬最佳提取工艺为70%乙醇回流提取3次，1h/次，加醇量为14倍量。结论 优选的工艺稳定可行，可作为开发飞蓬药材资源的参考。
       【关键词】  飞蓬 总黄酮 灯盏乙素 正交试验
       飞蓬Erigeron acer L．为菊科飞蓬属二年生草本植物，主要分布于我国西南、东北等省区。它与收载于1977年版《中国药典》且在临床上用于治疗心脑血管疾病的中药保护品种灯盏细辛为同属同亚组植物［1］。据《长白山植物药志》记载，其根、茎和叶均含鞣质，叶和花中含挥发油；其花和花序可治疗发热性疾病，种子治疗血性腹泻，煎剂治胃炎、腹泻、皮疹、疥疮等［2］。目前国内外对飞蓬的研究报道极少，仅有关于其化学成分的报道。现代研究表明飞蓬中主要有效成分之一是黄酮，而其中含量较多的是灯盏乙素（又名野黄芩苷）［3］。本文以总黄酮和灯盏乙素的含量为评价指标，优选提取飞蓬中黄酮类有效成分的工艺，为新药研究和充分利用飞蓬药材资源提供参考依据。
       1  仪器与材料
        1.1   仪器日本岛津高效液相色谱仪（N2000色谱工作站）；UV－1700紫外分光光度计（日本岛津公司）；超声波发生器（昆山市超声仪器有限公司）；HHSY21-Ni 4-C型电热恒温水浴锅（北京长源实验设备厂）。
        1.2   材料飞蓬干燥全草（采自长白山，经长春中医药大学邓明鲁教授鉴定）；野黄芩苷对照品，芦丁标准品（供含量测定用）购于中国药品生物制品检定所；其余试剂均为分析纯。
       2  方法与结果
        2.1  飞蓬总黄酮含量测定
        2.1.1   对照品溶液制备精密称取干燥至恒重的无水芦丁对照品5.05 mg置于25 ml容量瓶中，加适量70%的乙醇超声处理5 min，用乙醇定容至刻度，摇匀，得浓度为0.202 mg/ml的对照品储备液。
        2.1.2   供试品溶液制备精密称取样品干燥粉末1 g，置于50 ml容量瓶中，加适量70%的乙醇超声处理5 min，用乙醇定容至刻度，摇匀，作为供试品液。
        2.1.3   测定波长选择精密吸取芦丁对照品溶液0.5 ml和样品溶液1 ml于具塞试管中，精密加入5%亚硝酸钠溶液0.3 ml，摇匀，放置6 min，再加入10%硝酸铝0.3 ml，摇匀，放置6 min，加4%NaOH溶液4 ml，用70%的乙醇定容至10 ml，摇匀，放置10～15 min。以相同试剂为空白。在400～900 nm波长范围内扫描，记录最大吸收波长为510 nm，见图1。
        图1  芦丁和飞蓬样品最大吸收波长图
        2.1.4   标准曲线制作精密吸取标准芦丁溶液0.0，0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 ml分别加入6支具塞试管中，按照“2.1.3”项操作，于510 nm处测定吸光度。并以吸光度（A）为纵坐标，芦丁对照品溶液浓度（C, mg/ml）为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程： A＝11.227C-0.013，r＝0.999 9（n=6），见图2。结果表明：在0.101～1.01 mg范围内芦丁对照品显色后的吸光度与浓度呈良好线性关系。
        图2  芦丁标准曲线图
        2.1.5   供试品含量测定取供试品溶液0.2ml于具塞试管中，按照“2.1.3”项下操作，于510nm处测定吸光度,然后根据线性方程计算其总黄酮的含量。
        2.2   飞蓬灯盏乙素含量测定
        2.2.1   色谱条件Chmmasil C18柱(5 μm，4.6 mm×150 mm)；测定波长λ＝335 nm（依卫生部颁发的药品标准）；流动相：甲醇－0.1％磷酸（40：60）；流速1.0 ml／min。
        2.2.2   对照品溶液制备精密称取野黄芩苷对照品1.05 mg，置10 ml容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，过滤，摇匀，制成浓度为0.105 mg/ml的标准储备液。
        2.2.3   供试品溶液制备精密称取样品干燥粉末1 g，置于50 ml容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，过滤，摇匀，作为供试品液。
        2.2.4   标准曲线制作精密量取对照品溶液2，4，6，8，10，12，14，16 μl注入液相色谱仪，测定野黄芩苷色谱峰的面积。并以吸收峰面积（A）为纵坐标，进样量（C,μg）为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程：A=1 359 349.240 9C-68 257.651 7，r=0.999 9（n=8），结果表明野黄芩苷浓度在0.21～1.68 μg范围内与峰面积具有良好的线性关系。
        2.2.5   供试品含量测定精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μl，注入液相色谱仪，测定，即得，见图3。
        2.3   提取工艺的优选
        2.3.1   提取溶剂的优选称取100 g飞蓬，分别加入14倍量不同的提取溶剂，80℃水浴恒温提取2 h，抽滤，定容，分别按“2.1”测定总黄酮含量，按“2.2”项中方法测定灯盏乙素含量，结果见表1。 表1  不同提取溶剂的总黄酮和灯盏乙素含量
        从表1可知，碱液提取虽然得膏率很高，但是总黄酮和灯盏乙素含量低，且碱液提取加热容易破坏黄酮类化合物的母核。用水和乙醇作为提取溶剂，虽然得膏率相同，但是水提取的总黄酮和灯盏乙素含量较低，且由于其极性大，易把蛋白质、糖类等溶于水的成分浸提出来，使得提取液存放时，易腐败变质。乙醇提取的总黄酮和灯盏乙素含量高，因此为这3种溶剂中的最佳提取溶剂。下面的实验均采用乙醇作为提取溶剂，分别选取乙醇浸渍法、渗漉法、回流提取法、索氏提取法、超声波法进行提取。
        2.3.2   提取方法的优选称取100g飞蓬，分别选取乙醇浸渍法、渗漉法、回流提取法、索氏提取法、超声波法进行提取，提取液抽滤，定容，分别按“2.1”项中方法测定总黄酮含量，按“2.2”项中方法测定灯盏乙素含量。不同方法提取的飞蓬总黄酮和灯盏乙素含量测定结果见表2。 表2  不同提取方法的总黄酮和灯盏乙素含量
        经过实验证明，不同提取方法直接影响着醇提工艺中的总黄酮和灯盏乙素的测定结果。综合考虑，用回流法提取飞蓬中的总黄酮和灯盏乙素是比较合适的方法。为此，设计正交，进一步优化采用乙醇回流法进行提取的最佳醇提工艺。
        2.3.3   正交实验法优选飞蓬乙醇回流提取工艺根据实际情况，选择乙醇浓度、溶媒量、提取时间、提取次数作为考察因素，每个因素选择3个水平，因素水平表见表3。 表3  正交实验设计因素水平按均匀取样的规则取飞蓬100 g，按L9（34）正交实验表安排实验，每组两次平行实验，以总黄酮和灯盏乙素含量为评价指标，测定结果取平均值。结果见表4。 表4  正交实验方案与结果表5  方差分析
        以总黄酮提取率为考察指标，直观分析结果表明A2>D3>C1>B2；以灯盏乙素提取率为考察指标，直观分析结果表明A2>D3>C3>B3，方差分析（表5）结果表明A因素和D因素对总黄酮及灯盏乙素的提取均具有显著性影响，而B因素及C因素对提取结果没有影响，为了节省时间和能源，最终确定工艺条件为A2B1C1D3，即以70%乙醇回流提取3次，1 h/次，加醇量为每次14倍量。
        2.4   验证实验 称取药材按最佳工艺进行验证实验，结果表明总黄酮和灯盏乙素含量与正交实验结果吻合，取得较好的结果，说明该工艺可行。
       3   讨论［4］
        目前，提取工艺筛选试验中常用化学法、生物学法及有效浸出物综合评价的方法，因此实验中仅用一种评价指标筛选提取工艺条件往往不够全面。而且飞蓬中含有多种黄酮类化合物，采用紫外分光光度法测得结果通常是总黄酮的含量，并不能准确反映灯盏乙素的含量，本实验经研究建立了灯盏乙素含量测定的HPLC法，提高了准确度，稳定可靠。
        在实验中，曾试用了甲醇－0.5％磷酸溶液(45∶55)、甲醇－1％磷酸溶液(35∶65)、乙腈－1％冰醋酸(25∶75)为流动相条件，经反复比较，以正文所选流动相重复性最佳，出峰时间较快，峰形尖锐、对称，且灯盏乙素主峰与杂质峰明显分离。
        通过L9（34）正交实验，最终确定了飞蓬中总黄酮和灯盏乙素醇提工艺的最佳条件，并通过验证实验证明该工艺，稳定可靠，有效富集了飞蓬中总黄酮和灯盏乙素的含量，为进一步开发飞蓬中总黄酮有效部位奠定基础。
       【参考文献】
         ［1］ 林 容,陈艺林.中国飞蓬属及其邻属的研究［J］.植物分类学学报,1973,11：399.
       
       ［2］ 吉林省中医中药研究所,长白山自然保护区管理局,东北师范大学生物系.长白山植物药志［M］.长春：吉林人民出版社，1982：1177.
       
       ［3］ 胡宇慧,张 浩,张志锋.飞蓬属多种植物的化学成分含量研究［J］．药物分析杂志,2005,25(1)：21.
       
       ［4］ 谢秀琼.中药新制剂开发与应用［M］.北京：人民卫生出版社,2000：14.