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       【摘要】 
       目的对赤芝子实体进行化学成分研究，并对单体化合物进行细胞毒活性测定。方法利用硅胶柱层析，Sephadex LH-20柱色谱以及HPLC等手段分离纯化得到单体化合物，并进行结构鉴定，通过MTT法对其进行细胞毒活性测定。结果从赤芝子实体中分离并鉴定了3个单体化合物的结构，分别是灵芝醇B（Ⅰ），麦角甾醇（Ⅱ）和过氧化麦角甾醇（Ⅲ），这3个化合物对小鼠肺腺癌LA795细胞的IC50分别为77.9，22.5，84.9μg/ml。结论3种化合物皆有细胞毒活性，其中以麦角甾醇（Ⅱ）为最好。
       【关键词】  灵芝 分离 鉴定 细胞毒活性
       赤芝Ganoderma lucidum (Leyss.ex Fr.)Karst系担子菌纲多孔菌科灵芝属真菌，具有补中益气、滋外强壮、扶正固本、延年益寿等功效，被列为名贵药材。20世纪70年代以来，我国学者在中西医结合的学术思想指导下，运用现代医药生物技术先后对多种灵芝属真菌的子实体、菌丝体、孢子粉及发酵液的提取物或有效成分进行了系统的化学、药理学研究，对灵芝扶正固本作用的机理进行了有益的探索［1］。近年来，灵芝有效成分的分析及药理作用，临床应用等的研究已经引起国际上的关注。为了进一步研究其活性成分，本实验对赤芝子实体进行提取分离，得到3个化合物，经鉴定其结构分别为灵芝醇B（ganoderiol B，Ⅰ），麦角甾醇（ergosterol，Ⅱ）和过氧化麦角甾醇（ergosterol peroxide，Ⅲ），其体外抗肿瘤活性作用研究表明对小鼠肺腺癌LA795细胞具有细胞毒活性。
       1   仪器与材料
        Gulliver Series高效液相色谱仪(日本JASCO公司)；核磁共振谱仪(VARIAN INOVA 500MHz)；TECAN A-5002 Spectra型酶标仪(奥地利)。实验用硅胶(青岛海洋化工)；Sephadex LH-20(Amersham Pharmacia Biotech)；RPMI1640培养基(Gibco公司)；胎牛血清(天津市庆星科技有限公司)；噻唑蓝(MTT，Sigma公司)；二甲基亚砜(DMSO，Sigma公司)。
        赤芝Ganoderma lucidum(Fr.)Kart，由天津中新药业提供，经天津大学药物科学与技术学院高文远教授鉴定，植物标本现存于天津大学药物科学与技术学院天然药物学实验室。小鼠肺腺癌LA795细胞株，由中国协和医科大学基础医学研究所提供。
       2   提取分离
        将赤芝药材（5 kg）粉碎，用95%的乙醇（药材的10倍量）加热回流提取5h，过滤，滤渣再用10倍量95%乙醇加热回流提取，如此提取5次，合并滤液，减压浓缩至浸膏状，得提取物250g。将浸膏混悬水溶液分别用石油醚，醋酸乙酯，正丁醇萃取。其中石油醚层部分30g（100～200目硅胶400 g装柱），干法上样，采用石油醚－醋酸乙酯溶剂系统6个梯度（50∶1，20∶1，10∶1，5∶1，2∶1，0∶1）洗脱，共收集得到12个组份，从其第10个组分中经过硅胶层析分离得到化合物Ⅰ（218.2 mg）。醋酸乙酯层部分40g以（100～200目硅胶1000 g装柱）CHCl3-MeOH（100，99∶1，98∶2，95∶5，9∶1，85∶15，80∶20∶2，70∶30∶3， 6∶4，5∶5）梯度洗脱，共得到16个组分，对其第2个组分进行重结晶得到化合物Ⅱ，剩余部分经过凝胶柱层析和正相HPLC分离，得到化合物Ⅲ（10 mg）。
       3   结构鉴定
        化合物Ⅰ：白色晶体，1H-NMR(CDCl3，500Hz)δH：5.47(1H，d，J=6Hz，7-H)， 5.32(1H，d，J=6.5Hz，11-H)，5.40(1H，t，J=7Hz，24-H)，3.24(1H，dd，J=11.5，4.5)，4.00(2H，s，26-H)，1.67(3H，s，27-H)，1.01(3H，s，29-H)，0.985s(3H，s，30-H)， 0.92(3H，d，J=6.5Hz，21-H)， 0.88(3H，s，28-H)，0.88(3H，s，19-H)， 0.57(3H，s，18-H)。13CNMR数据见表1，以上数据与文献报道［2］的灵芝醇B相符。
        化合物Ⅱ ：白色晶体，1H-NMR(CDCl3，500Hz)δH:5.568(1H，d，6-H)， 5.384(1H，d，7-H)，5.204(1H，m，22-H)，5.204(1H，m，23-H)，3.637 (1H，m，3-H)，1.038(3H，d，21-H)，0.946(3H，s，19-H)，0.918(3H，d，25-H)，0.846(3H，d，27H)，0.831(3H，d，28H)，0.631(3H，s，18-H)。以上数据与文献报道的麦角甾醇［3］相符。分别以氯仿/甲醇(98:2，V/V)，石油醚/乙酸乙酯(1:4，V/V)做层析液，用麦角甾醇标准品作TLC对照，Rf值相同。因此确定为同一化合物。
        化合物Ⅲ：白色晶体，1H-NMR(CDCl3，500Hz)δH:6.50(1H，d，J=8.5Hz，6-H)，6.24(1H，d，J=8.5Hz，7-H)，5.22(1H，dd，J=15，7.5，23-H)，5.14(1H，dd，J=15，8，22-H)，3.95(1H，m，3-H)，0.908(3H，d，J=6.5Hz，21-H)，0.883(3H，s，19-H)，0.83 (3H，d，J=6.5Hz，26-H)，0.82(3H，d，J=6.5Hz，27H)，1.00(3H，d，J=6.5Hz，28H)，0.816(3H，s，18-H)。13CNMR数据见表1，以上数据与文献报道［4］的麦角甾醇过氧化物相符。表1  化合物Ⅰ、Ⅲ的13CNMR光谱数据
       4  细胞毒活性测定
        4.1   细胞培养小鼠肺腺癌LA795细胞株，为贴壁细胞，培养于含10%灭活胎牛血清，100 U/ml 青霉素，100μg /ml 链霉素的 RPMI1640培养液中，37℃，5%CO2培养箱及饱和湿度条件下培养，3～4 d 传代一次。
        4.2   MTT法将对数生长期细胞用胰酶消化后配制成浓度为3×104个/ml的细胞悬液，接种于96孔酶标板，每孔加200 μl。24 h后换不含血清RPMI1640培养液使细胞同步化生长，每孔200 μl。24h后(第 3 天)加含不同浓度药物及相应溶媒对照的新鲜培养液，每孔加200 μl，受试药设4个剂量组，每组设8个平行孔，并设空白孔调零。在上述条件下培养24 h后，每孔加无血清培养液新鲜配制的0.5 mg/ml MTT 100 μl，继续培养4 h，然后每孔加100 μl DMSO溶解MTT甲簪颗粒，用微型振荡器振荡混匀后，于酶标仪上测定光密度值(OD) ，实验重复 3 次，取平均值。以溶剂对照处理肿瘤细胞为对照组，由OD值计算抑制率，细胞生长抑制率(%)=（1-样品组OD值／对照组OD值）×100％。并由此求得IC50(半数抑制浓度) ，IC50=细胞生长抑制率为50%的药物浓度。
        实验结果见表2，显示化合物Ⅰ～Ⅲ对小鼠肺腺癌细胞LA795具有一定的细胞毒活性，其中以化合物Ⅱ为最好。表2   3 种化合物的细胞毒活性
       5  结论
        从赤芝子实体中分离得到3种单体化合物，并对其进行了体外细胞毒活性研究。结果显示，在测定浓度范围内3种化合物对LA795细胞的生长具有抑制作用，呈现出良好剂量效应关系，药物浓度越高，抑制作用越明显。灵芝的抗肿瘤作用自20世纪70年代以来得到国内外学者的关注，对其有效成分和作用机制进行了大量的研究。本实验对赤芝子实体中分离得到的单体化合物进行的细胞毒活性检测，对其抗肿瘤有效成分及抗肿瘤机制的进一步研究具有一定指导意义。
       【参考文献】
         ［1］ 林志彬.灵芝的现代研究［M］.北京医科大学出版社，2002.
       
       ［2］ 王芳生,蔡 辉,杨峻山，等.赤芝子实体中三萜化学成分的研究［J］.药学学报,1996,31(3):200.
       
       ［3］ 李厚金,林永成.麦角甾醇及其衍生物的氢化学位移溶剂效应［J］.分析测试学报,2004,23(3):26.
       
       ［4］ Joachim Rosecke，Wilfried A.Konig.Constituents of the fungi Daedalea quercina and Daedaleopsisconfragosa var. tricolor［J］.Phytochemistry，2000，54:757.