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       【摘要】 
       目的观察补肾康膝方含药血清对体外培养的兔关节软骨细胞的增殖凋亡和端粒酶活性的影响。方法取兔的关节软骨，将软骨细胞分离传代后,分为补肾康膝方含药血清组和对照组，置入37℃，50 ml/L的CO2培养箱内培养7 d 后,采用MTT 法检测细胞增殖; TUNEL 法检测各组软骨细胞的凋亡；软骨细胞经扩增后用ELISA 检测端粒酶活性。结果补肾康膝方高、中、低剂量组细胞增殖均高于对照组(P<0.05)；补肾康膝方含药血清各组的软骨细胞凋亡率明显低于对照组(P<0.05)；补肾康膝方含药血清各组的软骨细胞端粒酶活性明显高于对照组。结论 补肾康膝方可能通过上调软骨细胞端粒酶活性,从而抑制软骨细胞的凋亡。
       【关键词】  补肾方；软骨细胞；细胞凋亡；端粒酶
       Effect of Kidney-supplementing , Knee-invigorating Prescription on Proliferation and Apoptosis of Chondrocytes in Rabbits
       ZHAO Yu, CHEN Huayan, LIU Riguang
       (1.Guiyang College of Traditional Chinese Medicine, Guiyang  Guizhou 550002 , China;2.Affiliated Hospital of Guiyang Medical College,Guiyang 550004,China)
       Abstract:ObjectiveTo observe the effects of kidney-supplementing , knee-invigorating (KSKI) Prescription containing serum on proliferation and apoptosis of rabbit chondrocytes in vitro . MethodsThe chondrocytes were isolated from the cartilage of the rabbits , and were divided into 5 % , 10 % , 20 % KSKI prescription containing serum groups and control group. After the chondrocytes were cultured for 7 days in37 ℃,50 ml/L CO2 incubator , their proliferation , apoptosis and the telomerase activity were detected with MTT , TUNEL and PCR-ELISA respectively. ResultsThe proliferation of chondrocytes in 5 %，10 % ，20 %KSKI prescription containing serum groups were respectively higher than that in control group (P<0. 05) ；their apoptosis rates were respectively 　lower than 　that in control group ( P< 0.05)；their telomerase activities  were respectively higher than that in control group ( P< 0. 01) . Conclusion:KSKI Prescription can inhibit the apoptosis of chondrocytes by up-regulating the telomerase activity.
       Key words：Kidney-supplementing；  Knee-invigorating prescription；  Chondrocytes；  Apoptosis；  Telomerase
       
       骨关节炎主要的病理特征是软骨骨质的降解和软骨中细胞数目明显减少，软骨基质的合成和分解代谢失调，最终关节软骨被破坏。研究表明，软骨中唯一的细胞是软骨细胞，软骨基质主要是由软骨细胞合成和分泌的；软骨细胞的分裂增殖及凋亡的异常在骨关节炎的发病中起到十分重要的作用。补肾康膝方是治疗骨关节炎的经验方，对早期骨关节炎疗效显著，本研究主要从补肾康膝方对软骨细胞增殖和凋亡的影响探讨其防治骨关节炎的作用机制，为进一步研发和临床运用打下基础。
       1  材料与仪器
       1.1  动物　
       新西兰兔1 个月龄大，体质量2. 5kg ，雌雄各5 只，由贵阳医学院动物实验中心提供。
       1.2 试剂　
       胎牛血清(美国Sigma ,使用前灭活) 、Ⅱ型胶原酶(美国Sigma) 、1.0 g/ L 胰蛋白酶、0.2 g/ L EDTA、DMEM 培养液( Gibco公司) 、二甲基亚砜、MTT(美国Sigma公司) 、端粒酶PCR2EL ISA 检测试剂盒(德国Boehringer Manheiman) 、TUNEL 成套试剂盒(湖北省武汉博士德生物工程公司产品) 。
       1.3  仪器设备　
       Olympus 倒置显微镜、培养箱(Heraeus B25060 EK2CO2 ) 、超净台(上海净化设备厂CSB21) 、冷冻高速离心机(Heraeeus) 、酶标分析仪(Wellscan MKⅡ) 。
       2  方法
       2.1  兔血清制备　
       新西兰兔4只，雌雄各半。补肾康膝方(由淫羊藿、黄芪、牛膝、石斛、远志、骨碎补、补骨脂等组成) 按体表面积折算动物的等效剂量，再按10 ml/d 灌胃，正常兔血清以9.0 g/L氯化钠注射液按10 ml/d 灌胃。连续灌胃2 次，中间间隔2 h，分别在末次灌胃后3 h采血。在乙醚和氯胺酮复合麻醉下兔腹主动脉采血，4℃冰箱过夜后，离心(2500 r/min)25 min ，取上清液，抽滤除菌后分装，- 20℃保存备用。
       2.2  兔软骨细胞的分离与培养将6只新西兰兔空气栓塞处死后, 无菌条件下截取双侧胫骨近端、股骨远端关节软骨，置于D-Hank"s 液中冲洗。0.5 g/ L 透明质酸酶溶液室温下消化3 min ，将软骨切成约1 mm3大小，分别以2.0 g/L胰蛋白酶、2.0 g/L胶原酶溶液于37℃，50 ml/L CO2培养箱中孵 育60 min ，1 500 r/ min 离心3 min，弃上清液，网筛过滤后,加入100 ml/L 小牛血清，反复吹打后将软骨细胞接种在25 cm2的培养瓶中，置37 ℃，50 ml/ L CO2 培养箱中。原代细胞长满后传代培养。
       2.3  含药血清的加入传代细胞接种在24 孔板中，接种密度2 ×104 个/ cm2，分对照组(正常兔血清) 、补肾康膝方Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ组(含药血清分别为5%，10%，20%) 。每组选6 个培养孔，分别用相应的血清培养。
       2.4  检测方法及观测指标
       2.4.1  MTT 比色法检测软骨细胞增殖 
       软骨细胞培养7 d 后，每孔加MTT 20 μl(5 mg/ ml) 溶于PBS中，滤过除菌，放入培养箱4 h ，取出，每孔加入50 μl二甲基亚砜，振荡混匀使结晶物充分溶解。在全自动酶标仪上检测光密度OD值，检测波长为492 nm。
       2.4.2  TUNEL 法检测软骨细胞的凋亡 
       按博士德公司提供的检测试剂盒说明书操作。以胞浆出现棕色细小颗粒为阳性结果。阳性率计算：计数5个高倍视野(400 ×) 中的阳性细胞核(胞浆)数及总细胞核数，并计算阳性细胞核数占细胞核总数的百分比。
       2.4.3  端粒酶活性测定［1］ 
       不同方法处理的软骨细胞制备端粒酶提取液。取细胞提取液5 μl ，加入25 μlTRAP PCR 扩增液,在PCR 扩增仪上按以下步骤进行引物的延伸及扩增反应：25 ℃30 min、90 ℃5 min，循环1个周期；再94 ℃变性30 s，50 ℃30 s，72 ℃延伸90 s，共30个循环；最后72 ℃平衡10 min。取上述PCR 产物5 μl ，加变性液20 μl 混匀，置室温10 min，加入杂交液225 μl ，混匀后取出100 μl ，包被于抗地高辛的酶标板中室温作用2 h ，加入过氧化物酶并与底物显色作用30 min 后终止反应，测定450 nm 和690 nm 吸光度值，A 值= A450 - A690 。
       2.5  统计学方法　
       各组数据以±s表示，用SPSS软件包进行统计学分析，各组间比较采用非配对t 检验。
       3  结 果
        结果显示，补肾康膝方含药血清各组细胞增殖OD 值明显高于对照组，差异存在显著性(P<0. 05)；补肾康膝方含药血清各组软骨细胞凋亡率明显低于对照组，差异存在显著性(P< 0. 05) ；补肾康膝方含药血清各组软骨细胞端粒酶活性明显高于对照组，差异存在显著性( P< 0.01) 。见表1 。表1  补肾康膝方对家兔软骨细胞增殖、凋亡率和端粒酶活性的影响(略)
       4  讨论
        端粒(telomere)是真核生物染色体线性DNA分子末端的结构。在某些情况下，染色体可以断裂，这时染色体断端之间会发生融合，或断端被DNA 酶降解。但正常染色体不会整体地互相融合，也不会在末端出现遗传信息的丢失。可见，端粒在维持染色体的稳定性和DNA复制的完整性有重要作用。端粒酶(telomerase)在20 世纪80 年代中期被发现,它是一种RNA蛋白质复合物。复制终止时,染色体线性DNA 末端确有可能缩短，但通过端粒的不依赖模板的复制，可以补偿这种由除去引物引起的末端缩短。研究发现，培养的人成纤维细胞随着分裂次数的增加，端粒长度是在逐渐缩短的。并且发现,体细胞端粒长度大大短于生殖细胞，胚胎细胞的端粒也长于成年细胞。据此，至少可以认为细胞水平的老化，有可能与端粒酶的活性下降有关［2］。Sonsoles 等［3］实验表明，将端粒酶基因转染的人OA 软骨细胞的端粒变长，端粒酶表达增加，细胞寿命延长。
        骨关节炎是一种临床常见的老年人关节的退行性病变，它的发病率与年龄密切相关。Bennett等研究表明，60岁后，100 %的人膝关节软骨将发生组织学退变; 60%～70 %的个体存在确定的膝OA证据［4］。我国50 岁以上的人群中骨关节炎的发病率约为50% ，而65 岁以上患有此病的女性和男性分别高达90 %和80%。因此，软骨细胞端粒酶的活性的改变与骨关节炎的发病密切相关。本实验结果表明，补肾康膝方含药血清各浓度组的软骨细胞增殖OD值明显高于对照组(P<0.05) ，说明其能促进软骨细胞的增生；而软骨细胞凋亡率明显低于对照组(P<0.05) ，说明其具有抑制软骨细胞的异常凋亡的功效；此外，补肾康膝方含药血清各浓度组的软骨细胞端粒酶的活性明显高于对照组(P< 0.01) ，说明补肾康膝方可能通过上调软骨细胞的端粒酶的活性，抑制软骨细胞异常凋亡，从而起到防治骨关节炎的作用。
       【参考文献】
         　　［1］张莉萍,蒋红恺,刘祥贵. 聚合酶链反应检测肿瘤细胞株的端粒酶活性［J］.中华医学检验杂志,1998 ,21(3):139.
       
       ［2］周爱儒. 生物化学，第5 版［M］.北京：人民卫生出版社,2002：238.
       
       ［3］Sonsoles P，Sergio A , Jimenez , et al . Stokes Increased life span of human osteoarthritic chondrocytes by exogenous expression of telomerase［J］.Arthritis Rheum, 2001 ,23：1113.
       
       ［4］Cooper C. Osteoarthritis epidemiology ［A］.In：Klippel J ,Dieppe P (eds) . Rheumatology［C］.London : Mosby ,1994：731.