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       【摘要】 
       目的运用生物活性指纹图谱预测其它中药能否促进骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,bMMSCs）。方法龟版浸膏依次用石油醚、乙醚、二氯甲烷提取，得到溶剂提取物，用MTT 比色法及流式细胞仪器研究了溶剂提取物干细胞活性，采用GC-MS 技术研究每一个提取物，根据总离子流色谱图的相同保留时间和相应峰面积，获得龟版浸膏 GC-MS 生物活性指纹图谱。结果初步结果表明溶剂提取物均能促进鼠 bMMSCs 的体外增殖，用龟版浸膏GC-MS 生物活性指纹图谱来预测中药“四物汤”的干细胞活性，预测准确率达 83.3%。结论用这种方法来预测未知中药样品的干细胞活性，有一定的可靠性。
       【关键词】  龟版；干细胞；增殖；气相色谱-质谱联用分析；指纹图谱
       The Analysis and Application of Plastrum Testudinis GC-MS Fingerprint that Promotes the Proliferation of Stem Cells
       ZHANG Yuehua，ZENG Heping， CHEN Dongfeng
       1. Guangzhou City Polytechnic College,  Guangdong Guangzhou, 510405 China；
       2.Institute of the Functional Molecule, Department of Chemistry, South China University of Technology, Guangdong, Guangzhou, 510641 China;
       3.Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine, Guangdong Guangzhou 510405, China
       Abstract：ObjectiveTo predict the promoting effect of Chinese medicine on proliferation of rat bone marrow mesenchymal stem cells(bMMSCs) by bioactivity fingerprint in vitro.MethodsThe ointment of plastrum testudinis was extracted by petroleum ether,ether and dichloromethane in burn to gain the extracts.The effects on the proliferation of bMMSCs were examined by MTT assay and flow cytometry analysis, and each sample was studied by GC-MS. According to the total ion current chromatogram of the same retention time and the corresponding peak area, the GC-MS fingerprint of  bioactivity was gained.ResultsThe results showed that the substances extracted could promote the proliferation of stem cells. The fingerprint of bioactivity was used to evaluate the bioactivity of “Si Wu Tang”,and the accuracy rate reached 83.3%.ConclusionThis method is reliable to predict unknown Chinese medicine samples of stem cell activity.
       Key words：Plastrum testudinis；  Stem cell；  Proliferation；  GC-MS；  Fingerprint
       
       龟版始载于《神农本草经》，列为中品。正品龟版是动物乌龟的干燥腹甲，龟版性微寒，味微咸，气微腥，含胶质、钙盐、脂肪和角蛋白等，具有补心肾，滋阴降火，潜阳退虚热等功效［1］。近年来，将龟版提取后，找到了促进干细胞增殖的龟版有效部位（简称龟版浸膏）。龟版浸膏能促进鼠 bMMSCs 的体外增殖［2］，促进大鼠骨髓损伤后及局灶性脑缺血后神经干细胞增殖［3～5］，增强 bMMSCs 移殖后分化为神经元［6］；也可以在体外诱导成年大鼠bMMSCs 分化为神经元样细胞［7］，经过较长时间诱导后 bMMSCs 还可能向成骨方向分化［8］。这提示龟版一方面可以促进MSCs增殖，另一方面可能启动MSCs向神经方向和成骨方向分化。
       
       龟版的化学成分很复杂，通过对龟版的乙醇浸出物和水的浸出物进行游离氨基酸和水解后氨基酸及微量元素等化学成分分析，发现龟版含17种氨基酸及锌、铁等人体必需微量元素［9］；孙苏亚等［10］研究了从黄喉拟水龟龟版中分离出的3种甾类化合物：胆甾醇、十二烯酸胆甾醇酯和甾醇-4-烯-3-酮；他们还用 GC-MS 法研究了龟版中的脂肪酸类化合物［11］；姜大成等［12］从龟甲滋阴活性方面入手，用柱色谱和气相色谱分离并鉴定出具有滋阴活性的成分是十六烷酸胆甾醇酯和胆甾醇。
       
       龟版中什么化学组分起到调控干细胞增殖与分化成为我们感兴趣的问题。本课题组的研究初步确定龟版浸膏促进干细胞增殖不是单个分子的作用，而是多个分子协同作用的结果。于是我们考虑研究龟版浸膏GC-MS 生物活性指纹图谱。
       
       用 MTT 比色法和流式细胞仪检测了溶剂提取物的干细胞活性，结果表明3个溶剂提取物均能促进鼠 bMMSCs 的体外增殖。采用 GC-MS 技术研究每一个提取物，根据总离子流色谱图，得到促进 bMMSCs 增殖的龟版浸膏溶剂提取物 GC-MS 指纹图谱（简称为提取物指纹图谱），目的在于运用生物活性指纹图谱预测其它中药能否促进 bMMSCs 增殖。
       1  器材与方法
       1.1  仪器和试剂
       Trace DSQ型气相色谱-质谱联用仪（美国 Finnigan INC公司生产）， EPICS XL-MCL型流式细胞分析仪（美国COULTER公司生产），所有试剂均为分析纯，龟版浸膏由广东中医药大学提供。
       1.2 溶剂提取物样品的制备称取龟版浸膏 2 g，分别用250 ml石油醚、乙醚、二氯甲烷加热回流24 h后，分出各溶剂提取物，自然挥干后，得到溶剂提取物样品，分别记为石油醚提取物（Z-1）、乙醚提取物（Z-2）、二氯甲烷提取物（Z-3）；各称取 30 mg 溶剂提取物样品提供做促进鼠 bMMSCs 的体外增殖实验，称取 10 mg 用二氯甲烷定容供做 GC-MS 分析。
       1.3  GC-MS实验条件
       色谱条件为DB-5 石英毛细管柱 (30 m × 0.25 mm), 载气为氦气，柱前压 50 kPa，进样口温度为 280 ℃。升温程序： 60 ℃ ( 不保留 ) ，以 8 ℃ /min 升至 280 ℃，保留 20 min 。质谱条件： EI 源，离子源温度 250 ℃，轰击电子能量 70 ev ，电子倍增器电压 1.7 kv ，质量扫描范围 28～500 amu 。联结：直接式。
        用 bMMSCs 法测MSCs增殖。所得数据用±s表示，采用方差分析。用流式细胞仪分析检测细胞周期的变化。
       2  结果
       2.1  MTT法测定
       bMMSCs 增殖活性用 MTT 法测定 bMMSCs 增殖活性（OD值）。见表1。表1  MTT 法测定 bMMSCs 活性(略)
        由图1（横坐标表示样品及浓度，如“Z-1-0.75”表示Z-1样品组在 0.75 μg/μl 浓度时，其它同）可见，Z-1，Z-2，Z-3 均能促进 bMMSCs 增殖，有些浓度的 OD 值暂缺，由于在测试过程细胞受污染，未能得到准确的 OD 值。
       2.2 流式细胞仪测试
       bMMSCs 活性为了证明MTT结果的准确性，我们抽取 Z-1 样品用流式细胞仪分析测试，对照组及样品组对 bMMSCs 活性的影响见（图2～3）。碱性成纤维生长因子（bFGF）阳性对照组浓度为 20 ng/ml，Z-1样品组浓度为 0.09 μg/μl。由图3可见在 0.09 μg/μl浓度时 Z-1样品组能促进 bMMSCs 增殖，与 MTT 结果一致。
       2.3  龟版浸膏
       GC-MS 生物活性指纹图谱根据石油醚、乙醚、二氯甲烷提取物样品（即Z-1，Z-2，Z-3）和总离子流色谱图，找出相同保留时间的色谱峰及相应峰面积，取平均峰面积，各保留时间及峰面积见表 2。以保留时间(min)为横坐标，以平均峰面积A为纵坐标（×106），运用 Origin 6.1软件作出提取物指纹图谱，见图4。表2  提取物指纹图谱数据（略）
       2.4  提取物指纹图谱应用
       用提取物指纹图谱预测中药汤剂 “四物汤”的生物活性。四物汤是中药熟地黄、当归、白芍药、川芎4味中药的复方，主要功效是补血活血，按照质量比1∶1∶1∶1的比例取一定量四物汤，用醋酸乙酯索氏抽提，抽提物用醋酸乙酯和石油醚进行柱层析，得到20个组分，分别记作T-1～T-20。20个样品在和上述 GC-MS 相同条件下分析，得到总离子流色谱图，分别与提取物指纹图谱对照。
       
       通过与提取物指纹图谱对照，发现T-2，T-3，T-5，T-6，T-7，T-8，T-9，T-10，T-16，T-18，T-19，T-20 的总离子流色谱图从保留时间上看，与该指纹图谱较相似，保留时间相似度达 70% 以上，由此我们预测这几个样品能促进 bMMSCs 增殖。我们将这几个样品作图，与提取物指纹图谱对照，如图5～16所示，并在相同条件下进行 bMMSCs 体外增殖实验。结果表明，T-3，T-5，T-6，T-7，T-8，T-9，T-10，T-16，T-18，T-19，T-20在 1.5μg/μl浓度时均能促进 bMMSCs 增殖，这与我们预测的一致；但 T-2 在该浓度时对 bMMSCs 增殖起抑制作用，T-8 在该浓度时促进 bMMSCs 增殖效果不明显，与我们预测的不一致，结果见图5～17，预测准确率达83.3%。
       3  结论
        以上结果说明，用这种方法来预测未知中药样品的干细胞活性，有一定的可靠性，预测准确率达83.3%，但也存在着一定的误差。这可能是因为仅考虑保留时间相似度在70%以上，而不是100%；未考虑峰的强度，各个样品从强度上看，与指纹图谱的相似性较低，而峰的强度也是一个关键因素，因有些物质浓度过高反而会起抑制作用。因此，用生物活性指纹图谱来预测未知样品的生物活性时，应同时考虑保留时间和色谱峰的强度。
       【参考文献】
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