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       【摘要】 
       目的探讨消癌平注射液对人食管癌细胞(Ec-9706)的抑制作用及其作用机理。方法①观察不同浓度消癌平注射液对Ec-9706的抑制率。②用倒置显微镜，丫啶橙染色（荧光显微镜）观察细胞用药前后形态变化；流式细胞仪检测用药前后细胞周期变化；免疫细胞化学法检测CyclinD1表达。结果①消癌平40，20 ，10，5 mg/ml浓度时对EC-9706细胞的生长抑制率分别为（90.15±2.74）%，（68.02±3.56）%，（48.73±1.79）%，（22.52±2.08）%。其OD值与空白对照组差异有统计学意义(P<0.05)。其IC50值为(10.89±1.05）mg/ml。②消癌平可诱导Ec-9706凋亡。③EC-9706经药物作用后，G0/G1期细胞百分比明显升高，S期细胞百分比明显下降，细胞被阻滞于G0/G1期。④Ec-9706在蛋白水平不表达CyclinD1。结论消癌平对Ec-9706细胞有较好的抑制作用。
       【关键词】  消癌平； 食管癌细胞； 丫啶橙； 流式细胞术
       Effect of Xiaoaiping Injection on Ec-9706 Cell Line
       ZHANG Mingzhi,HE Zhen*,WU Guangyin,XING Ze,SONG Min,WANG Ruilin
       (Oncology Department,The First Affiliated Hospital of Zhengzhou University,Zhengzhou 450052， China)
       Abstract:ObjectiveTo observe the inhibitory effect and mechanism of Xiaoaiping(XAP, a kind of traditional Chinese medicine) Injection on esophagus carcinoma cell line (Ec-9706). Methods①In vitro inhibition experiments were undertaken for Ec-9706 cells with XAP 40，20，10 and 5 mg/ml concentrations, respectively. ②The cellular shape was observed by invert microscope and acridine orange staining with fluorescent microscope, flow cytometry was applied to detect the difference of cell cycle, and immunohistochemistry was applied to the expression of CyclinD1. Results①XAP Injection could remarkably inhibit the growth of EC-9706 cells. When 40mg/ml, 20mg/ml, 10mg/ml, 5mg/ml XAP Injection was cultivated with EC-9706 cells, the IR was （90.15±2.74）%, （68.02±3.56）%, （48.73±1.79）%, （22.52±2.08）% respectively. The difference between every experimental group and control group was significant (P＜0.01). IC50 was （10.89±1.05）mg/ml. ②XAP could induce Ec-9706 cell line to apoptosis. ③Flow cytometry analysis showed that cellular periods were （59.56 ±1.73）%, （86.68±2.57）%, （83.26±1.86）% in G0/G1 period, respectively, after XAP Injection (10，20，40 mg/ml) mixed with Ec-9706 cellular strains for 48 hours . The differences between experimental group and control group were significant (P<0.05). ④CyclinD1 didn"t express in protein level in Ec-9706 cell line. ConclusionXAP appears to have good inhibitory effect on esophagus carcinoma cellular strains.
       Key words:Xiaoaiping Injection;   Esophagus carcinoma cell line;   Acridine orange;    Flowingcytometry
        近年来，临床应用消癌平注射液治疗各种晚期恶性肿瘤，取得了改善症状、缩小及稳定瘤灶、提高生活质量、延长生存期的临床效果［1，2］。为了进一步证实消癌平的作用及作用机理，我们观察了消癌平对人食管癌细胞Ec-9706生长抑制作用。
       1  材料
       1.1  药品消癌平注射液由南京圣和药业有限公司提供，批号：200511281，棕黄色澄清液体，20 ml/支；顺铂(DDP) 齐鲁制药有限公司生产(生产批号:0504015)。
       1.2  人食管癌细胞株(Ec-9706) 由中国医学科学院肿瘤研究所分子肿瘤学国家重点实验室王明荣教授惠赠。
       1.3  CyclinD1免疫组化试剂盒购于北京中杉生物技术有限公司。
       2  方法
       2.1  MTT比色法测定药物抗癌活性及IC50值  取对数生长期Ec-9706细胞，常规消化，用RPMI-1640配成单细胞悬液，以每孔104～105个细胞接种于96孔培养板中，常规培养24 h细胞大部分已贴壁，吸出原培养液，实验组加不同浓度的消癌平注射液的培养液，使其终浓度分别为40，20，10，5 mg/ml；阳性对照组加顺铂，终浓度为10 μg/ml；空白对照组加等体积生理盐水。每组设4个平行孔，另设本底对照孔。继续培养48 h后，加入MTT溶液，继续孵育4 h，加入DMSO，振荡，使结晶物充分溶解。选择570 nm波长，测定各孔光吸收值。计算生长抑制率（按以下公式），求IC50值。
        细胞生长抑制率（%）＝对照组OD均值-实验组OD均值对照组OD均值×100%
       2.2  形态学变化观察  
       食管癌细胞经15 mg/ml药物作用48 h后，置显微镜下观察细胞形态学的改变，并拍照记录。
       2.3  丫啶橙荧光染色的观察
       ①将生长有培养细胞的玻片放入95%乙醇中固定，干燥；②在1%醋酸中酸化30 s；③加足量的0.01%丫啶橙磷酸缓冲染液，染色5～10 min；④用pH 4.8磷酸缓冲液洗1 min；⑤ 0.1 mol/L氯化钙分化30 s或几分钟；⑥PBS漂洗，封片；⑦在荧光显微镜下观察，用蓝紫光激发滤片。
       2.4  流式细胞术(FCM)检测细胞周期改变  
       取对数生长期细胞，常规制成单细胞悬液，以1.25 ×105/ml密度接种于培养瓶中，24 h加入各浓度消癌平注射液(10，20，40 mg/ml)培养24 h，收集细胞(1×106)，移入离心管中，1 000 r/min离心5 min，用PBS溶液清洗一次，在离心管中留约0.5 ml PBS，加入70%冰乙醇5ml混匀固定，4℃放置48 h以上。检测时，离心离去乙醇，PBS清洗一次，在离心管中留1 ml PBS，加入Rnase 5 μl(10 mg/ml)，37℃放置1 h，加入PI（100 μg/ml）染液，室温避光染色30 min，计数10 000个细胞，流式细胞仪检测细胞周期时相，采用FACSTar plus上运用Csellfit DNA 分析软件进行测定和分析。
       2.5  检测CyclinD1的表达  
       按免疫组化试剂盒步骤进行操作。
       2.6  统计学处理  
       应用SPSS11.5统计软件，采用t检验和χ2检验。以α= 0.05作为检验水准。
       3  结果
        消癌平40，20，10，5 mg/ml浓度时，对Ec-9706食管癌细胞的抑制率为（90.15±2.74）%，（68.02±3.56）%，（48.73±1.79）%，（22.52±2.08）%，与空白对照组有显著性差异(P＜0.01)。其高浓度的抑制率与顺铂(89.33±2.81)% 相仿（P＞0.05），药物作用48 h 后的IC50 为（10.89±1.05）mg/ml。结果见表1。表1  不同浓度消癌平注射液对Ec-9706（略）
        光镜下细胞形态学改变：对照组细胞大小均一，呈上皮型贴壁生长，细胞多呈长梭形，部分细胞呈多角形或圆形，轮廓清楚，细胞间结构紧密，胞浆均匀透明，折光性好，细胞生长旺盛；消癌平注射液作用48 h后部分细胞体积变小、逐渐变圆并浮起，细胞间接触变松，折光性及贴壁能力减弱，胞内颗粒增多，出现典型的凋亡小体。上述细胞改变随药物浓度的增加及作用时间的延长而逐渐增多。结果见图1。
        丫啶橙染色观察细胞凋亡形态学改变：荧光显微镜下细胞核DNA为黄色或黄绿色均匀荧光，细胞质和核仁的RNA为桔黄或桔红色荧光。细胞凋亡时，细胞核或细胞质内可见致密浓染的黄绿色染色，甚或见黄绿色碎片。细胞坏死时细胞质内黄绿色或桔黄色荧光均可见减弱或消失。结果见图2。
       各浓度消癌平对Ec-9706细胞生长周期影响：流式细胞分析仪监测显示，食管癌细胞株的各期分布如下：空白对照组G0/G1期为55.86 %，S期44.14%；消癌平10 mg/ml作用后G0/G1期为59.56 %，S期44.44 %；20 mg/ml作用后G0/G1期为86.68 %，S期13.32 %；40 mg/ml作用后G0/G1期为83.26%，S期16.74%。Ec-9706细胞经不同药物作用后，G0/G1期细胞百分比明显升高，各实验组S期细胞百分率明显下降，细胞被阻滞于G0/G1期。结果见图3。
       免疫组化结果：本组实验Ec-9706细胞胞核、胞浆均未着色，而阳性对照组细胞（食管癌Ea109细胞）胞核着色，呈棕黄色细颗粒状，少部分细胞有胞核、胞浆同时着色，经4次重复实验，结果一致，可能该Ec-9706细胞株在蛋白水平不表达或低表达CyclinD1，以至于不能被免疫化学法检测。结果见图4。
       
       4  讨论
        消癌平是从乌骨藤中提取的注射液。乌骨藤为萝藦科牛奶菜属植物，主要生长在贵州、广东、广西和福建等地。植物分析消癌平主要含有多糖、生物碱和皂苷等有效成分［3］。近年有文献报道运用口服消癌平糖浆和静脉苷注射消癌平针剂治疗食管癌取得较好的临床疗效［1，3，4］。本实验观察了乌骨藤提取物——消癌平注射液体外抗人食管癌Ec-9706活性，并应用细胞及分子生物学技术初步探讨了消癌平注射液体外抗肿瘤作用的可能机制，为其临床应用提供实验依据。
       
       消癌平的体外实验表明，该药对Ec-9706食管癌细胞株有直接生长抑制作用，MTT法测其高浓度抑制率可达90%以上，与顺铂相仿，我们进行了重复实验，证实了结果的可靠性。消癌平对体外培养的人食管癌细胞的生长抑制作用与其临床上抗癌效果一致。消癌平抑制食管癌Ec-9706的机制研究结果表明：①消癌平作用后，细胞体积变小，细胞间接触变松，折光性及贴壁能力减弱，胞内颗粒增多，出现凋亡小体。在丫啶橙荧光染色更清晰可见细胞核或细胞质内致密浓染的黄绿色染色，甚或见黄绿色碎片的典型凋亡改变，说明消癌平能诱导癌细胞凋亡。②消癌平能降低食管癌细胞的恶性程度，抑制食管癌细胞生长，DNA合成期(S期)的细胞比例数下降，G0/G1 期细胞增多，药物呈现出明显的诱导细胞分化倾向［5，6］。③由流式细胞学结果推测细胞的周期蛋白表达应会有所改变，结果测CyclinD1免疫组化示阴性，该细胞株在蛋白水平不表达CyclinD1。总之，消癌平对食管癌细胞有较好的抑制作用，其作用机制有待更深入、更广泛的基础研究。
       【参考文献】
         　　［1］梁素美, 文欣轩, 王 静, 等. 消癌平注射液治疗43例晚期消化道系统肿瘤的临床观察［J］.中国临床医药研究杂志, 2003,93:9234.
       
       ［2］温建珍, 郝 青, 杨 玲. 消癌平注射液治疗老年晚期消化道肿瘤57例［J］.中国民间疗法, 2003, 11(6): 48.
       
       ［3］张文平, 王昌利, 仲 英, 等. 乌骨藤及其制剂的研究进展［J］.齐鲁药事, 2006, 25(5)：293.
       
       ［4］王志良, 王贵吉, 岳邦仪. 中药通光藤治疗食管癌胃癌的临床观察(附112 例报告)［J］.河南肿瘤学杂志, 1995, 8 (3)：202.
       
       ［5］李茂全, 沈建华, 胥 彬, 等.消癌平对SGC-7901胃癌细胞的作用及机制的实验研究［J］.介入放射学杂志,2001, 10(4)：228.
       
       ［6］孙珏,沈建华，朱美华，等.消癌平对人胃癌细胞治疗作用的实验研究［J］.上海中医药大学学报,2000, 14(2)：41.