文章标题 全文   多个检索词，请用空格间隔。

       【摘要】 
       目的观察加味四逆散对肝脏转化生长因子β1（TGFβ1）、结缔组织生长因子（CTGF） mRNA的影响，探讨其抗肝纤维化的作用机制。方法采用二甲基亚硝胺腹腔注射制备大鼠肝纤维化模型，加味四逆散灌胃给药，采用实时定量PCR技术检测各组大鼠肝组织TGFβ1和CTGF mRNA表达的水平。结果加味四逆散能明显降低肝纤维化大鼠肝组织TGFβ1和CTGF mRNA水平，与病理模型组比较有显著性差异（P<0.05）。结论加味四逆散能够降低肝组织TGFβ1和CTGF mRNA表达，从而发挥其抗纤维化的作用。
       【关键词】  加味四逆散 肝纤维化 肝脏转化生长因子 结缔组织生长因子
       加味四逆散是治疗慢性病毒性肝炎的有效经验方，既往的临床观察和动物实验研究已经证实该方具有良好的防治肝纤维化作用［1～3］。本实验采用二甲基亚硝胺（DMN）腹腔注射诱导肝纤维化大鼠动物模型，应用实时定量PCR技术检测大鼠肝组织中转化生长因子β1（TGFβ1）、结缔组织生长因子（CTGF）mRAN表达，探讨加味四逆散抗肝纤维化的作用机制。
       1  材料
       1.1  动物SD大鼠60只，雄性，清洁级，体重(180±20) g，由第四军医大学实验动物中心购进。
       1.2  药品及试剂加味四逆散煎剂由柴胡、枳壳、白芍、甘草、黄芪、丹参、桃仁等药组成，自陕西中医学院附院药房购进，经本院药物鉴定教研室鉴定无伪劣品。药物加水浸泡常规煎煮，过滤，水浴蒸发至每毫升含生药3.5 g，置于4℃冰箱保存备用。二甲基亚硝胺(Sigma公司)。秋水仙碱（云南医药集团云南药业有限公司生产，批号：20020208）、TRIzol Regent（Invitrogen 公司）、RT-PCR Kit（大连宝生物工程有限公司）。
       2  方法
       2.1  动物模型制备大鼠在适应性饲养1周后随机选取12只作为空白对照组（A 组），其余48只均用DMN（用生理盐水稀释至5 mg/ml）以10 ml/kg体重腹腔注射，1次/d，每周连续3 d，连续4周。
       2.2  分组4周造模结束后，48只大鼠共死亡8只，死亡率为16.7%，将剩余40只造模大鼠随机分为：病理模型组（B组）16只 ，秋水仙碱组（C组）12只，中药治疗组（D组）12只。
       2.3  给药A、B组：以生理盐水4 ml/只灌胃；C组：以秋水仙碱0.01 mg/kg体重灌胃；D组：以加味四逆散煎剂10 ml/kg体重灌胃。以上各组用药均1次/d，连续用药30 d后结束。
       2.4  标本制作实验结束后取部分新鲜肝组织用10%甲醛固定，石蜡包埋，连续切片，片厚5 μm。
       2.5  普通病理组织学观察病理组织学分级标准为［4］：“-”级:正常肝脏或无明显胶原纤维增生；“±”级：胶原纤维增生，中央静脉和汇管区有少量纤维索放散延伸，但无间隔形成；“+”级：胶原纤维增生，中央静脉和汇管区结缔组织变厚，由此向四周伸出纤维索，形成不完全间隔；“++”级：胶原纤维大量增生，有个别菲薄的完全间隔形成（假小叶）；“+++”级：完全间隔较厚，假小叶大量形成。
       2.6  RNA抽提和RT反应实验结束后取部分新鲜肝组织，按照Trizol试剂说明提取总RNA，加入20 μl DEPC-treated水溶解，用紫外分光光度计260/280进行样品的浓度测定和质量鉴定，电泳证实总RNA的完整性。取2 μg总RAN，按试剂盒 (大连宝生物工程有限公司，RT-PCR Kit) 说明书进行操作，合成cDNA。
       2.7  实时定量PCR（Real-time PCR）根据目的基因在Genbank中的已知序列用primer premier 5.0设计引物，由大连宝生物工程有限公司合成。引物序列见表1。表1  PCR中应用的引物序列（略）
       2.8  统计学处理所有数据应用SPSS10.0软件处理, 参数值用±s表示,组间比较采用ｔ检验（P<0.05为有显著性差异）。
       3  结果
       3.1  加味四逆散对大鼠症状表现的影响实验期间空白组大鼠一直精神状态佳，皮毛光滑密泽，大便正常，进食无异常。所有造模组大鼠，则出现不同程度的精神不振，反应迟钝，饮食摄水明显减少，粪便稀薄，皮毛凌乱，缺乏光泽；治疗组于治疗3周后，大便逐渐干燥，进食、摄水增加，精神状态亦随之好转。实验过程中模型组大鼠死亡5只，可能为肝纤维化进行性加重而死亡。
       3.2  加味四逆散对肝纤维化组织病理学的影响实验结束后，光镜下观察可见：空白对照组：HE染色见肝组织结构清晰，胶原纤维染色仅于汇管区和中央静脉有少许胶原纤维存在。模型组：HE染色见肝组织结构欠清晰，汇管区及小叶内中度炎性细胞浸润；胶原纤维染色显示汇管区大量胶原沉积，呈较宽的条索状纤维深入肝小叶。各治疗组大鼠仅见轻度汇管区炎症，胶原纤维染色显示纤维结缔组织增生程度减轻，与模型组比较有显著性差异（P<0.05）。说明加味四逆散组对肝纤维化有良好的治疗作用。结果见表2。表2  肝纤维化各组大鼠肝脏病理组织学变化（略）
       3.3  定量PCR结果分析由表3可见：病理模型组、秋水仙碱组和加味四逆散组与空白对照组比较TGFβ1、CTGFmRNA 表达水平增高，差异均有显著性（P<0.05）。秋水仙碱组和加味四逆散组与病理模型组比较TGFβ1、CTGFmRAN  表达水平降低，差异均有显著性（P<0.05）。表3  TGFβ1、CTGFmRNA的表达（略）
       4  讨论
          
       肝纤维化是慢性肝炎向肝硬变发展的必经阶段，是继发于肝脏炎症或损伤后组织修复过程中的代偿反应。近年来研究发现星状细胞(HSC)是肝纤维化形成的关键。HSC活化后不仅细胞大量增殖，而且还表现为细胞个体分泌纤维能力增强，大量生成细胞外基质（ECM），并可自分泌TGFβ1，CTGF等细胞因子维持自身活化状态。TGFβ1能特异性的诱导肝星状细胞产生CTGF，CTGF作为其下游效应介质增强TGFβ1对成纤维细胞和肝星状细胞的作用，刺激星状细胞和成纤维细胞增殖和ECM的合成与分泌［6，7］。所以减少TGFβ1、CTGF在肝组织中的分泌可以减少ECM的合成与分泌。本实验结束后表明与空白对照组比较模型组肝组织中TGFβ1，CTGF mRNA 表达水平增高，而加味四逆散组和秋水仙碱组与病理模型组比较TGFβ1，CTGF mRNA 表达水平降低。表明了加味四逆散可有效的降低肝组织中TGFβ1，CTGFmRNA的表达，推测其机制可能为抑制HSC的活化与增殖，抑制细胞因子的分泌，减少ECM的生成，从而发挥其抗肝纤维化的作用。
       【参考文献】
         　　［1］孙守才，刘光炜.加味四逆散治疗慢性乙型肝炎肝纤维化的初步研究［J］. 陕西中医学院学报，2001,24（1）：46.
       
       ［2］孙守才，李晓苗，曾福海， 等. 加味四逆散防治大鼠免疫性肝纤维化的实验研究［J］. 陕西中医学院报，2001,29：32.
       
       ［3］孙守才，刘光炜，曾福海，等. 加味四逆散对肝纤维化大鼠血清透明质酸、层粘连蛋白、Ⅳ型胶原及肝脏超微结构的影响［J］. 中国中医基础医学杂志，2002,11：56.
       
       ［4］中华医学会传染病寄生虫病学分会、肝病学分会.病毒性肝炎防治方案.2000年9月西安会议.
       
       ［5］Yin JL, Shackel NA, Zekry A, et al. Real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction(RT-PCT) for measurement of cytokine and growth factor mRNA expression with fluorogenic probes or SYBR Green I［J］. Immunol Cell Biol, 2001,79(3):213.
       
       ［6］杨艳宏，蔡卫民，金国梁，等日本血吸虫感染兔肝成纤维细胞的动态变化及其意义［J］.中华医学杂志，1999，79（11）：870.
       
       ［7］Grotendorst GR H,Hayashi N.A novel transforming factor beta response element controls the expression of connective tissue growth factor gene［J］.cell grower differ，1996，7(4)：469.