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       【摘要】 
       目的利用四氯化碳诱导大鼠急性肝损伤模型，研究小球藻提取物对急性肝损伤的保护作用。方法利用四氯化碳诱导大鼠急性肝损伤，测定大鼠血清中丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）活性，肝组织中谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）水平及谷胱甘肽过氧化酶(GSH-Px)活性，分析小球藻提取物对上述指标的影响。结果小球藻提取物显著降低大鼠血清中ALT，AST以及肝组织中MDA值并促进肝组织中GSH-Px活性及GSH含量的升高。结论小球藻提取物对四氯化碳所致大鼠急性肝损伤具有明显的防治作用。
       【关键词】  小球藻； 四氯化碳； 肝损害
       Hepatoprotective Effect of Aqueous Extract of Chlorella vulgaris against Acute Hepatic Injury in Rats
       MENG Nan, HUANG YU-jing, KIM Yong-ho, SUN Li-xin*
       （School of Pharmacology, Shenyang Pharmaceutical University, 110016 China; Department of Biomedical Laboratory Science, Inje University, 621749,Korea）
       Abstract：ObjectiveTo study the protective effects of aqueous extract of Chlorella vulgaris (AEC) against CCl4-induced hepatic injury in rats. MethodsThe activities of serum ALT and AST were detected. The levels of hepatic GSH and MDA and the activity of GSH-Px in the liver were also determined. ResultsThe activities of serum AST, ALT and the degree of hepatic MDA were reduced significantly by AEC. Meanwhile, AEC restored the hepatic GSH content and GSH-Px activity. ConclusionAEC has a good protective effect on acute hepatic injury in rats.
       Key words：Chlorella vulgaris；  Carbon tetrachloride (CCl4)；  Hepatoprotective
       
       四氯化碳（CCl4）是一种经典的肝毒物，其致肝损害可能与膜脂质过氧化有关［1］。小球藻Chlorella vulgaris为绿藻门普生性单细胞藻类，含丰富的蛋白质、脂质、多糖、食用纤维、维生素、微量元素和活性代谢物，常作为医疗保健品［2～4］。关于小球藻水提物的体外抗氧化活性已有报道［5］。本实验通过四氯化碳致大鼠肝损伤模型，研究了小球藻水提物对大鼠肝损伤的保护作用。
       1  器材与方法
       1.1  材料
       1.1.1   药品与试剂四氯化碳(CCl4)、谷胱甘肽(GSH)、还原型辅酶Ⅱ、玉米油（美国Sigma公司），丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)试剂盒（韩国 ASAN PHARM 公司），丙二醛(MDA)试剂盒(美国Oxford Biomedical Research公司)。
       1.1.2   仪器Optizen分光光度计(韩国Mecasys公司)，Synergy HT多功能酶标仪（美国BIOTEK公司）,Optima L-100XP超速离心机（美国Beckman公司）， 匀浆机（美国IKA Works公司）。
       1.1.3   动物健康雄性Sprague-Dawley大鼠60只，体重（160～180g），购于韩国Hyo-Chang Science公司。小球藻由韩国Marine Microalgae Culture Center提供。
       1.2   方法
       1.2.1   提取物的制备将500 g干燥的小球藻粉混悬于适量蒸馏水中，90℃提取30 min，提取两次，合并提取液，离心60 min，上清液用1 μm玻璃纤维滤器过滤后，冷冻干燥，得粗粉63 g，于-20℃保存备用。
       1.2.2   动物分组及给药方法健康雄性大鼠60只，随机分为正常组，模型组，小球藻提取物大剂量组、中剂量组、小剂量组和阳性对照组6个组，每组10只。小球藻提取物给药组分别按10，5，2.5 g/kg量予小球藻提取物灌胃， 阳性对照组按0.3 g/kg水飞蓟素灌胃，正常组、模型组按等体积生理盐水灌胃，共7 d。末次给药1h后，模型组和给药组腹腔注射20%CCl4玉米油溶液(2 ml/kg)， 正常组腹腔注射等体积玉米油溶液，禁食, 不禁水。24 h后乌拉坦麻醉，下腔静脉取血，离心后取得血清，置于-20℃保存。采血后迅速摘除肝脏，用冷PBS缓冲液洗涤干净，滤纸吸干水分后，-80℃保存。
       1.2.3   检测方法按试剂盒说明测定血清中AST，ALT活性及肝组织中MDA含量。肝组织中谷胱甘肽过氧化酶（GSH-Px）活性测定参照Lawrence RA等［6］的方法。GSH含量测定按照Teiz, F［7］的方法，将肝组织匀浆、离心后，取上清液测定。
       1.3   统计学方法数据以±s表示，使用SPSS11.5分析软件对各组进行方差分析(ANOVA)，P<0.05认为有统计学意义。
       2  结果
       2.1   对血清ALT及AST的影响如表1所示，一次腹腔注射给大鼠CCl4后24h，CCl4模型组和给药组血清ALT及AST均显著上升，说明肝细胞受损，但小球藻提取物明显降低CCl4所致ALT及AST的升高（P<0.05或P<0.01）。
       2.2   对肝组织MDA，GSH，GSH-Px的影响MDA含量在注射CCl424 h后水平明显升高，但给药组明显低于CCl4模型组（P<0.05或P<0.01）。同时，小球藻水提物明显提高肝组织内GSH含量(P<0.05)，增强GSH-Px活性（P<0.05或P<0.01）。结果见表2。
       表1  小球藻水提物对CCl4所致急性肝损伤大鼠血清ALT, AST的影响（略）
       与模型组比较, *P<0.05, **P<0.01；n=10
       表2  小球藻水提物对CCl4所致急性肝损伤大鼠MDA, GSH, GSH-Px的影响（略）
       与模型组比较, *P<0.05, **P<0.01；n=10
       3  讨论
       
       CCl4是制作试验性肝损伤的常用药物。CCl4进入体内经肝药酶450激活产生三氯甲基过氧自由基和氯自由基，引起生物膜脂质过氧化并与膜上脂质及蛋白质分子进行不可逆结合，导致肝细胞的损伤坏死，使细胞内转氨酶溢出进入血液，从而造成ALT及AST活性的升高［8］。MDA是多不饱和脂肪酸被氧化的产物，其含量的多少能反映机体内脂质过氧化的程度。GSH是属于含有巯基的、小分子肽类物质。GSH（尤其是肝细胞内的GSH）具有非常重要的生理作用就是整合解毒作用，能与某些药物（如扑热息痛）、毒素（如自由基、重金属）等结合，参与生物转化作用，从而把机体内有害的毒物转化为无害的物质，排出体外。谷胱甘肽过氧化酶是重要的催化过氧化氢分解的酶，它特异性的催化还原性GSH对过氧化氢的还原反应，从而起到保护细胞膜结构与功能的完整作用。研究表明，肝损伤可引起肝组织中谷胱甘肽过氧化酶活性以及GSH含量的降低［9］。
       
       本实验结果表明，小球藻提取物能增加肝组织中GSH含量，增强GSH-PX活性，进一步提高了组织的抗氧化能力和解毒能力，通过抑制自由基的产生和促进自由基的转化排出，降低CCl4对大鼠肝组织的损伤作用，降低了生物膜脂质过氧化的发生，增强生物膜的稳定性，从而降低大鼠血清中AST，ALT及肝组织中MDA值，提示小球藻提取物对CCl4所致大鼠急性肝损伤具有一定的防治作用。
       【参考文献】
         　　［1］ 仲来福，张瑾岗，张富勤，等. 四氯化碳致大鼠肝损伤的机理［J］. 中国药理学与毒理学杂志，1989，4：298.
       
       ［2］ 刘学铭,梁世中. 小球藻在食品工业中的应用及小球藻食品的研制［J］. 武汉食品工业学院学报,1999,1:47.
       
       ［3］ De Souza QJ, Malacrida SA, Justo GZ, et al. Myelopoietic response in mice exposed to acute cold/restraint stress:Modulation by chlorella vulgaris prophylactic treatment ［J］. Immunopharmacol Immunotoxicol, 2004, 26(3):455.
       
       ［4］ 杨鹭生,李国平,陈林水.蛋白核小球藻粉的蛋白质氨基酸含量及营养价值评价［J］.亚热带植物科学，2004，32(1):36.
       
       ［5］ Wu LC,Ho JA,Shien MC, et al. Antioxidant and antiproliferative activities of Spirulina and Chlorella water extracts［J］. J Aqric Food Chem, 2005,53(10) :4207.
       
       ［6］ Lawrence RA, Burk RF. Glutathione peroxidase activity in selenium-deficient rat liver［J］. Biochem Biophys Res Commun., 1976, 71:952.
       
       ［7］ TEITZ, F. Enzymatic method for quantitative determination for nanogram amounts of total and oxidized glutathione［J］. Anal. Biochem, 1969,27: 502.
       
       ［8］ Shimizu I, Mm YR, Mizobuchi Y, et al. Effects of Sho-saiko-to, a Japanese Herbal Medicine, on hepatic Fibrosis in Rats［J］. Hepatology, 1999, 29(1): 149.
       
       ［9］ 金香子,金 政,蔡英兰.决明子水提物对D-半乳糖中毒大鼠急性肝损伤的保护作用［J］.时珍国医国药,2007,18(3):582.