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       【摘要】 
       目的观察丹芍化纤胶囊对肺纤维化大鼠肺组织结缔组织生长因子(CTGF)表达的影响，探讨其治疗肺纤维化的作用及机制。方法将48只Wistar大鼠随机分为对照组、肺纤维化组、丹芍化纤高剂量预防组和丹芍化纤低剂量预防组，每组12只。肺纤维化组、丹芍化纤高剂量预防组和丹芍化纤低剂量预防组以气管内滴入博来霉素(5mg/kg)建立肺纤维化模型，丹芍化纤高剂量预防组和丹芍化纤低剂量预防组分别经胃管注入丹芍化纤胶囊0.6，0.3 g/kg，1次/d。HE染色检测肺组织肺泡炎及肺纤维化程度；测定血清羟脯氨酸（HYP）的含量；免疫组化染色检测CTGF的表达。结果与对照组比较，肺纤维化组CTGF的表达显著增高。丹芍化纤高剂量预防组和丹芍化纤低剂量预防组与肺纤维化组比较，CTGF的表达均显著降低。 结论丹芍化纤胶囊可能通过抑制大鼠肺组织CTGF的表达，从而具有抗肺纤维化的作用。
       【关键词】  丹芍化纤胶囊； 肺纤维化； 结缔组织生长因子
       Effect of DanShaoHuaXian Capsules on Expession of CTGF in Lungs of Rats with Pulmonary Fibrosis
       CHENG Yingqiang,WU Yayun,MU Mao*,WEI Xiaoyu,HE Yun, CHENG Mingliang
       （Infectious Department, Hospital Affiliated to Guiyang Medical College, Guiyang, Guizhou 550004, China）
       Abstract：ObjectiveTo investigate the effects of DanShaoHuaXian Capsules on the expression of CTGF in lungs of rats with pulmonary fibrosis, and to explore the mechanism．Methods48 wistar rats were randomly divided into control group，pulmonary fibrosis group, high dose preventive group and low dose preventive group .A rat model of pulmonary fibrosis was established by the intratracheal injection of bleomycin(5 mg/kg). DanShaoHuaXian Capsules were administered intragastricly the preventive group with a dose of 0.6 g/kg，0.3 g/kg  respectively everyday for 4 weeks. The alveolitis and pulmonary fibrosis were examined by HE staining. The serum HYP was examined .The expression of CTGF was tested by immunohistochemical assay. ResultsCompared with the control group, the expression of CTGF in the pulmonary fibrosis group was significantly increased. Compared with the pulmonary fibrosis group, the expression of CTGF in DanShaoHuaXian Capsules preventive group was significantly decreased. ConclusionDanShaoHuaXian Capsules may have a treatment effect on pulmonary fibrosis through inhibiting the expression of CTGF in the lungs of rats with pulmonary fibrosis.
       Key words:DanShaoHuaXian Capsules；  Pulmonary fibrosis；  CTGF
       
       丹芍化纤胶囊主要由汉防己甲素、丹参、赤芍、黄芪、银杏叶等组成。近年来有研究显示，丹芍化纤胶囊对大鼠肝纤维化具有一定的抑制作用［1，2］。但关于丹芍化纤胶囊能否抑制肺纤维化，目前报道较少。有鉴于此，本研究采用免疫组化的方法检测了博来霉素肺纤维化大鼠肺组织内的CTGF表达，并观察了丹芍化纤胶囊对其表达的影响，以探讨丹芍化纤胶囊抗肺纤维化的作用机理。
       1  仪器与材料
       1.1  动物和试剂Wistar 大鼠48只，清洁级，体重180～220 g，雌雄各半，贵阳医学院实验动物中心提供。丹芍化纤胶囊由贵阳制药厂生产，主要成分为汉防己甲素、丹芍、赤芍、黄芪、银杏叶等，临用前倾出胶囊内粉末内容物，用蒸馏水稀释至所需浓度；博来霉素 （15 mg/支）；兔抗大鼠CTGF、SABC试剂盒、DAB显色试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）。
       1.2  仪器日立7170A 全自动生化分析仪，TE2000-u荧光相差倒置生物显微镜，COOLPIX450高级数码像机， Image-pro plus 专业图像分析软件系统。
       2  方法
       2.1  分组将大鼠随机分为4组：对照组、肺纤维化组、丹芍化纤高剂量预防组和丹芍化纤低剂量预防组，每组12只大鼠。肺纤维化组、丹芍化纤高剂量预防组和丹芍化纤低剂量预防组大鼠气管内滴入博来霉素(5 mg/kg体重，溶于0.3 ml生理盐水)，建立肺纤维化模型。对照组予等量生理盐水气管内滴入。从第2天起，丹芍化纤高剂量预防组和丹芍化纤低剂量预防组分别经胃管注入丹芍化纤胶囊0.6 g/kg体重、0.3 g/kg体重（溶于3ml生理盐水），1次/d。肺纤维化组和对照组大鼠予以3ml生理盐水灌胃,共28 d。第29天，处死大鼠，取下腔静脉血测定血清羟脯氨酸(HYP)的含量；剪下左肺下叶于4%多聚甲醛(含0.1%DEPC)中固定后，常规石蜡包埋，切片，分别进行HE染色、免疫组化法（SP法）检测CTGF (操作按照免疫组化试剂盒说明书进行)。显微镜下观察胞浆呈棕黄色或棕褐色颗粒为阳性表达。每张切片随机选取5个高倍镜视野（400×），计算各组显微镜下高倍镜视野的阳性细胞表达百分比。
       2.2  统计学分析采用SPSS13.0软件进行统计学分析，所测数据以±s表示，组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）。P<0.05为差异有统计学意义。
       3  结果
       3.1  对大鼠肺组织HE染色切片观察对照组肺组织结构正常，肺泡间隔无明显充血及水肿，肺泡内未见明显炎性细胞。肺纤维化组肺泡间隔明显增宽伴重度纤维组织增生，肺泡腔变形，含有较多炎性细胞。丹芍化纤高剂量预防组和丹芍化纤低剂量预防组，肺泡间隔增宽及炎性细胞浸润均较肺纤维化组明显减轻。
       3.2  血清羟脯氨酸(HYP)的含量  肺纤维化组血清HYP的含量明显高于对照组（P<0.01）；丹芍化纤高剂量预防组和丹芍化纤低剂量预防组血清HYP的含量均较肺纤维化组降低，差异有统计学意义（P<0.05），而对照组、丹芍化纤高剂量预防组和丹芍化纤低剂量预防组三组之间比较无明显差异（P＞0.05），结果见表1。
       表1  各组大鼠血清HYP的含量（略）
       与对照组比较，*P<0.01 ；与肺纤维化组比较，#P<0.05；n=12
       3.3  免疫组化检测CTGF阳性表达百分比在对照组中CTGF阳性表达较少；在肺纤维化组中可见CTGF阳性表达较对照组明显增加（P<0.01）；丹芍化纤高剂量预防组和丹芍化纤低剂量预防组中CTGF阳性表达均较肺纤维化组明显减少，差异有统计学意义（P<0.01），且呈剂量依赖性。结果见表2。
       表2  各组大鼠肺组织CTGF阳性表达百分比（略）
       与对照组比较，*P<0.01；与肺纤维化组比较，#P<0.01；与丹芍化纤高剂量预防组比较，★P<0.01；n=12
       4  讨论
       
       丹芍化纤胶囊是根据中医活血化淤、通络软坚的理论及多年的临床探索研制而成的中药复方制剂。以往的研究表明该药在预防大鼠肝纤维化方面作用明显，但在肺纤维化的治疗方面，目前报道较少。
       
       胶原纤维主要由胶原蛋白所构成，羟脯氨酸为胶原蛋白所特有的氨基酸成分，其在肺组织中的含量可反映胶原代谢的变化情况，与肺纤维化程度平行。在本实验第4周，病理组织学检查发现肺纤维化组大鼠肺组织的纤维化程度较对照组明显严重。肺纤维化组血清HYP含量也比对照组明显增加，进一步说明了前者的纤维化程度重于后者。经过丹芍化纤胶囊治疗4周后，丹芍化纤高剂量预防组和丹芍化纤低剂量预防组大鼠血清HYP显著下降，明显低于肺纤维化组，且呈剂量依赖性，与病理组织学检查一致，提示丹芍化纤胶囊对肺纤维化具有一定治疗作用。
       
       肺纤维化是各种慢性肺疾病共同的病理基础，其核心是细胞外基质的异常沉积。一旦肺脏受损，产生的炎性应答可促使多种细胞因子释放, 有些细胞因子可活化肺成纤维细胞，从而导致细胞外基质的合成异常增加。因此，细胞因子与肺纤维化的关系日益受到人们的重视。
       
       CTGF 是近年来新发现的一种细胞因子，是具有高度保守性的CNN 家族成员之一，为富含半胱氨酸的分泌肽［3，4］，具有促进有丝分裂、趋化细胞、诱导黏附、促进细胞增生和细胞外基质合成等作用，并参与机体组织的创伤修复过程［5］。在生理状态时，机体组织细胞可有基础量的CTGF分泌；而病理状态下，CTGF 的过度表达则与纤维化的发生发展有着密切的关系［6，7］。
       
       实验中发现，博来霉素肺纤维化组大鼠肺组织CTGF表达明显较对照组增加(P<0.01）。经丹芍化纤胶囊治疗4周后，大鼠肺组织中CTGF 的表达较肺纤维化组明显减少，且呈剂量依赖性关系。CTGF 主要在TGF-β1 的诱导下由成纤维细胞合成和分泌［8］。一般认为，TGF-β1是促进纤维化发展的最重要的细胞因子之一。而CTGF 可能是TGF-β1发挥生物学效应的下游因子。因此，抑制CTGF 的表达就有可能相应抑制地TGF-β1的促纤维化作用。本研究结果提示丹芍化纤胶囊抗肺纤维化的机制可能是通过抑制CTGF 的表达而实现的。
       【参考文献】
         　　［1］ 胡爱荣，丁一生，程明亮. 丹芍化纤胶囊对肝纤维化大鼠肺星状细胞增殖、活化及凋亡的影响［J］.中华肝脏病杂志，2006，14（2）：141.
       
       ［2］ 吴亚云，耿小霞，程明亮. 丹芍化纤方对体外大鼠肺细胞增生、Caspase-3mRNA及白蛋白合成的影响［J］.世界华人消化杂志，2005，13（6）：781.
       
       ［3］ 黄海长，李惊子，王海燕. 结缔组织生长因子诱导肾成纤维细胞转为肌成纤维细胞［J］.科学通报，2002，47 (1)：37.
       
       ［4］ 赵 青，陈 楠，王伟铭，等.结缔组织生长因子在肾间质纤维化中的表达及其意义［J］.肾脏病与透析肾移植杂志，2002，11(1)：21.
       
       ［5］ 黄海泉. CTGF 在糖尿病肾脏肥大中的作用［J］.国外医学·泌尿系统分册，2003，23(5)：547.
       
       ［6］ Zhang WS，Cheng ML，Lu YY. Effect of HanDanGanLe on the cytokines in fibrotic rats［J］. Chinese Liver Diseases Journal，2003，11(5)：285.
       
       ［7］ Paradis V，Dargere D，Bonvoust F，et al. Effects and regulation of connective tissue growth factor on hepatic stellate cells［J］. Lab Invest，2002，82(6)：767.
       
       ［8］ Nicolai Sedlaczek，JiDong Jia，Michael Bauer，et al.Proliferating bile duct epithelial cells are a major source of connective tissue growth factor in rat biliary fibrosis［J］. American Journal of Pathology，2001，158：1239.