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       【摘要】 
       目的草杞颗粒对荷瘤小鼠的抗肿瘤作用机制。方法 取昆明种小鼠18～22 g，雌雄各半，共50只，接种S180肿瘤细胞在腋窝皮下0.2 ml，然后分组为：阴性组(空白组)，24 h后灌胃给水0.5 ml/20 g，1次/d，连续8 d;阳性组，灌胃给5氟尿嘧啶(5-Fu)25 mg/kg;草杞颗粒小剂量组生药2.21 g生药/kg，中剂量组4.43 g /kg，大剂量组8.85 g生药/kg，上述每组均在接种肿瘤后24 h灌胃给药，1次/d，连续8 d，次日称重、剥离瘤块，入10%中性福尔马林固定。用免疫组化法观察促凋亡免疫酶标抗体Bax、Bcl-6、Hsp27的表达。结果草杞颗粒组均见有大片肿瘤细胞坏死、凋亡，小组累计坏死分数在小、中、大剂量组分别为2.28，2.50和2.76，坏死程度随剂量增大呈线性增加关系。促凋亡免疫酶标抗体Bax、Bcl-6、Hsp27较5-Fu组(1.74)有明显的阳性强度表达增加。结论草杞颗粒能促进肿瘤细胞凋亡，抑制S180肿瘤细胞生长周期。
       【关键词】  草杞颗粒; 抗肿瘤; 细胞凋亡
       Study on the Tumor Inhibitory Effect of Caoqi Granule
       FANG Zhijun1, SHAO Xiangqun1,HANG Guifang1,KONG Ming1,LUO Xin1,PEN Yunru1,ZHANG Jian1,QIAN Dawei1,XU Hefen1,LAI Rensheng2,WANG Yixian3
       (1.Jiangsu Provincial Academy of TCM, Nanjing,210028,China;2. Jiangsu Provincial Hospital of TCM, Nanjing,210005,China;3. Jiangsu Provincial Institute of Cancer Research, Nanjing,210008,China)
       Abstract：ObjectiveTo observe the anti-tumor effect and explore the possible mechanism of Caoqi granule on tumor bearing mice. MethodsThe mice were transplanted by armpit injection of S180 tumor cells, and divided into positive control(5-FU), low dose group (Caoqi keli,2.21 g/kg),middle dose group (Caoqi keli,4.43 g/kg) and high dose group (Caoqi keli,8.85g/kg). Using immnunohistochemical staining technique, we detected the apoptotic related gene Bax, Bcl-6, Hsp27 protein expression. ResultsThe phenomena of a large of tumor cell death and apoptosis were observed. The death index of three therapy groups with Caoqi keli was 2.26(low)、2.50(middle) and 2.76(high),which was higher than that of the positive group(1.74).The expression of apoptotic related gene Bax, Bcl-6, Hsp27 were higher than that of model and positive group.ConclusionCaoqi granule can induce tumor cell death and apoptosis and inhibit the growth of S180 tumor cell line in vivo.
       Key words：Caoqi granule; Anti-tumor; Apoptosis
       我院肿瘤科学术带头人徐荷芬主任医师是江苏省著名中西医结合肿瘤专家，在长期临床实践中，积累了用中医中药治疗肿瘤的经验，形成了自己的学术思想，强调整体观念，有的放矢地辨证用药。草杞颗粒是根据徐荷芬主任医师长期临床实践经验研制的。为进一步了解草杞颗粒的抗肿瘤机制，本实验采用免疫组织化学的方法检测细胞凋亡相关蛋白Bax、Bcl-6、Hsp27的表达情况。
       1 材料与仪器
       昆明种小鼠，由江苏省肿瘤防治研究所实验动物房提供，合格证：苏(动)质字第97005，(2000)环类21号，小鼠移植性肉瘤180(S180)，由中科院上海药物研究所提供，本室传代保种。草杞颗粒(每克浸膏含生药1.76 g，批号020118)由江苏省中医药研究院提供;5氟脲嘧啶(5-FU)由南通制药厂生产，批号：000828。酶联免疫检测仪(DG3022A)，分析天平(sartorius)，净化台(苏州净化设备公司YJ875)，Leica显微镜。
       2 方法
       2.1 分组取昆明种小鼠18～22 g，雌雄各半，共50只，接种S180肿瘤细胞在腋窝皮下0.2 ml，然后分组，每组雌雄各半，平均体重差(±s)不超过1 g。分为阴性组(空白组)、阳性组及草杞颗粒小、中、大3个剂量组。每组10只。阴性组，24 h后灌胃给水0.5 ml/20g，1次/d，连续8 d;阳性组，灌胃给5-Fu 25 mg/kg;草杞颗粒小剂量组(2.21g生药/kg)、中剂量组(4.43g生药/kg)、大剂量组(8.85 g生药/kg)，均在接种肿瘤后24 h灌胃给药，1次/d，连续8 d，次日称重、剥离瘤块，入10%中性福尔马林固定，每组随机选择6例进行免疫组代观察。
       2.2 病理及免疫组化
       2.2.1 病理小鼠肿瘤组织均经常规取材、脱水，石蜡包理、切片、HE染色镜检，观察指标为：
       肿瘤生长状态：包括肿瘤细胞退行性变，核分裂，连片生长，浸润生长.
       肿瘤坏死形态：①点状坏死，及早期坏死：<10个肿瘤细胞核固缩，浆退离互相解离，嗜酸或液溶解，灶性散在;②片状坏死：>11个肿瘤细胞的彻底坏死，片状分布;③条纹状坏死：>11个肿瘤细胞彻底坏死，量条纹索状分布。
       坏死/生长分数(N/G分数)：指肿瘤细胞全切片面积中坏死区面积与生活区面积之比。用Leica显微镜，连续在10×物镜下移动10个视野，在纵横坐标分别80 nm×110 nm面积刻度指示下测每新视野中5个生活面积中的坏死面积数(X/5)，对每例小鼠均累计10个新视野的坏死面积数除以生长面积数，得到平均N/G分数。
       淋巴组织增生：观察每例肿瘤组织内外淋巴小结生成及增生情况。
       2.2.2 免疫组化以DAKO公司产促凋亡一抗Bax(1∶100)、Bcl-6(1∶120)、热休克蛋白Hsp27(1∶150)和鼠实验用二抗及S-P链霉蛋白检测上述5组中每组6例，每例均标记Bax,Bcl-6和Hsp27。阳性细胞数以<10%为(-)，>10%(++)。
       2.3 统计对每组6只小鼠平均N/G分数相加得各小组总体N/G分数，另可比较每组内平均N/G分数，以计数指标进行统计学分析; 对各组Bax、Bcl-6和Hsp27检测结果，以(-)无阳性反应，(+)点状阳性反应，(++)片状弥漫性阳性反应，累计并进行计数资料统计。
       3 结果
       3.1 病理观察
       3.1.1 空白组6例均见肿瘤细胞连片生长，并浸润至肌间隙，可见2例有明显核分裂，但每例均见核固缩、浆淡染等退变，有1例见淋巴结反应增生，坏死区主要为片状，少数为条纹状，未见点状坏死，累计小组生长分数1.20。
       3.1.2 阳性组6例肿瘤细胞多数连片生长，4例见活跃核分裂，退行性变4例，但大多数(5例)见大片状坏死，未见点状坏死，累计小组生长分数1.74，2例淋巴结反应增生。
       3.1.3 草杞颗粒组共18例：①小剂量组5例连片生长，2例有核分裂，5例退行性变，5例见大片状坏死，4例线状坏死，无点状坏死，累计小组N/G分数为2.26，2例见淋巴结增生反应;②中剂量组6例均有连片生长，5例可见核分裂，2例退行性变，坏死形态5例呈连片坏死，4例呈线状坏死，累计小组N/G分数为2.50，2例为淋巴结反应;③大剂量组6例均呈连片生长，3例有明显核分裂，2例退行性变，6例均为大片状坏死，4例为线状坏死，未见点状坏死，累计N/G分数2.76。结果见表1。表1 草杞颗粒治疗昆明小鼠S180肿瘤生长坏死病理观察
       3.2 免疫组化
       3.2.1 Bax对肿瘤细胞主要成胞浆阳性，散在的肿瘤细胞及坏死区边缘和不彻底坏死区阳性瘤细胞较多，凋亡细胞多数体积变小，核固缩模糊，退行性变，胞浆为棕黄色，少数体积自溶解涨大，偶见个别大凋亡细胞核凋亡生芽(31)，淋巴窦内淋巴细胞有阳性表达，治疗以后有减少，且阳性细胞淡入皮质髓质深部消失。
       3.2.2 Bcl-6阳性肿瘤细胞呈膜型及浆型，前者以在早期凋亡状态和脂肪浸润区，后者在坏死区边缘多见。
       3.2.3 Hsp27阳性细胞少数为膜型，多数为浆型，淋巴细胞也可阳性表达在窦内。结果见表2。表2 草杞颗粒促凋亡抗体标记阳性表达状况
       4 讨论
       依据病理形态观察，接种S180肿瘤昆明小鼠经5-FU治疗，有明显坏死和凋亡发生。其小组累计坏死分数为1.74，伴有瘤周淋巴结反应性增生，而空白组自然性缺血性坏死，小组累计坏死分数为1.20。促凋亡Bax、Bcl-6和Hsp27阳性表达例数和强度均高于空白组。
       草杞颗粒方组治疗S180肿瘤昆明小鼠，均有大片肿瘤细胞坏死、凋亡，小组累计坏死分数在小、中、大剂量组分别为2.28、2.50和2.76，坏死程度随剂量增大呈线性增加关系。促凋亡免疫酶标抗体如Bax，Bcl-6，Hsp27较阳性对照组有明显的阳性强度表达增加。
       草杞颗粒为中药复方制剂，由白花蛇舌草、枸杞等中药提取精制而成，祛邪扶正是其治则。实验研究发现草杞颗粒对S180及Heps实体瘤均表现出明显的抑瘤作用，与60Co或化疗药 (CTX、5-FU、VP16)联合使用有减毒增效作用[1，2]。白花蛇舌草水溶性提取物不但能抑制小鼠移植性S180实体瘤的生长，而且与CTX合用，可以昆明显改善CTX所致的免疫器官萎缩和造血系统的损伤[3]，枸杞多糖具有提高免疫、诱生IL-2、IFN产生作用[4]。其作用机制可能是使G2-M期细胞增加，及G0-G1期和S期细胞减少，同时有促使癌细胞凋亡的作用。本研究显示，促凋亡基因Bax、Bcl-6、Hsp27阳性表达增加明显，从而诱导肿瘤细胞凋亡增加。然详细机制以及与其他信号通路的关系有待进一步深入研究。
       【参考文献】
         　　[1] 方志军,复方蛇舌草颗粒抗肿瘤作用的实验研究[J].中医研究,2002,15(5)：11.
       
       [2] 王 秋,方志军.草杞颗粒对荷瘤小鼠化放疗的减毒增效作用研究[J].中华现代医学与临床,2006,5(2):60.
       
       [3] Li Rui,Zhao Haoru，Lin Yining. Ant-tumor Effect and Protective Effect on Chemotherapeutic Damage of Water Solube Extracts from Hedyotis diffusa[J]. Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences,2002,11(2):54.
       
       [4] 孙 燕.抗肿瘤新药临床试验的发展及经验和教训[J].中国新药杂志，2000，9(3)：145.