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       【摘要】 
       目的通过观察肠道高敏性IBS大鼠模型肠组织及脊髓后角P物质(SP)、血管活性肠肽(VIP)免疫反应阳性神经纤维表达的变化，探讨痛泻要方可能的作用机制。方法采用直肠慢性刺激法制作肠道高敏性肠易激综合征模型。将实验动物分为空白对照组、模型对照组、中药低剂量组、中药高剂量组、西药组。观察各组大鼠肠道敏感性指标，用免疫组织化学法对各组大鼠回盲部、结肠及脊髓后角SP、VIP的表达进行半定量分析。结果痛泻要方能提高肠道容量阈值，减少收缩反射次数;降低模型大鼠肠组织及脊髓SP、VIP免疫反应水平，呈一定量-效关系。结论痛泻要方可降低肠道敏感性，其机制可能在于调节肠道初级感觉神经纤维及脊髓后角SP、VIP的分泌，减弱背角神经兴奋性，从而提高内脏痛阈。
       【关键词】  痛泻要方; 肠易激综合征; 肠道高敏性; P物质; 血管活性肠肽
       Effects of Tongxieyaofang on the Expressions of SP and VIP of Intestine and Posterior Horn of Spinal Cord in Rat Model of Visceral Hypersensitivity
       PENG Wei, PAN Jinyao, MA Jun, ZHENG Dejun
       (First People"s Municipal Hospital, Guangzhou Medical College, Guangzhou510180,China)
       Abstract：ObjectiveTo investigate the effect of Tongxieyaofang on the expressions of SP and VIP in rat model of visceral hypersensitivity . MethodsThe visceral hypersensitivity rats were induced by chronic stress excitation. The rats were divided into five groups: control, model, 15g/kg of Tongxieyaofang, 30g/kg of Tongxieyaofang and Dicetel. The visceral minimum volume threshold and frequency of contraction reflects were observed. The expressions of SP and VIP in ileocecal junction tissue, colon tissue and posterior horn of spinal cord were analyzed semiquantitatively with the immunohistochemistry method. ResultsTongxieyaofang could increase the visceral minimum volume threshold and decrease the frequency of contraction reflects. The expressions of SP and VIP in ileocecal junction tissue, colon tissue and posterior horn of spinal cord were lower than those in model group, and it depended on the dose of Tongxieyaofang. ConclusionAdjustment to the secretion of SP and VIP in intestinal tissue and posterior horn of spinal cord may be one of important mechanisms of therapeutic effect of Tongxieyaofang on IBS, which can reduce the excitability of DRG and visceral hypersensitivity.
       Key words： Tongxieyaofang; Irritable bowel syndrome; Visceral hypersensitivity; SP; VIP
       肠易激综合征(Irritable Bowel Syndrome，IBS)在临床上很常见，是一种感觉动力紊乱所致的肠功能疾病，其病因和发病机制至今尚不完全清楚，以感觉异常和动力改变为特征的内脏高敏感性是IBS最重要的病理生理特征之一，而P物质(substance P，SP)、血管活性肠肽(Vasoactive intestinal peptide，VIP)可能在其中起到重要作用。痛泻要方由炒白术、炒白芍、炒陈皮、防风4药组成，常用于IBS的治疗。本实验采用醋酸直肠慢性刺激法造成肠道高敏性IBS大鼠模型，通过观察肠道敏感性指标及回盲部、结肠及脊髓后角组织中SP、VIP阳性神经纤维表达的变化，探讨痛泻要方对IBS的作用机制。
       1 材料与仪器
       1.1 动物 SPF级新生SD大鼠50只，雌雄不限，年龄8d，由广州中医药大学实验动物中心提供，动物合格证号：0028263。
       1.2 药物白术、白芍、陈皮、防风购自广州中医药大学第一附属医院，按处方比例取一定量的药材，水煎后溶液按要求浓缩到所需浓度。得舒特(匹维溴铵)，法国苏威制药生产，批号：500113。将其碾碎后溶于蒸馏水，每毫升含药1.5 mg。
       1.3 试剂 兔抗SP抗体为北京博奥森生物公司产品，兔抗VIP抗体、多聚赖氨酸为武汉博士德生物公司产品，即用型兔二步法检测试剂盒、3,3"-二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒、枸橼酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液(PBS)为北京中杉金桥生物公司产品。
       1.4 仪器 Image-Pro Plus 6.0病理图像分析系统。
       2 方法
       2.1 动物模型的制备 参考文献[1，2]方法，模型组采用醋酸结肠慢性刺激法造成肠道高敏性IBS大鼠模型。正常对照组大鼠每天直肠内给予相同容积的0.9%生理盐水。连续造模2周。
       2.2 动物分组与给药 将实验动物随机分成正常对照组、模型组、痛泻要方低剂量组、痛泻要方高剂量组、得舒特组，每组10只。在醋酸刺激停止后第2天开始，正常对照组和模型组各给予0.9%生理盐水10 ml/kg灌胃，西药组以10 ml(15 mg)/kg灌胃，痛泻要方低剂量组、高剂量组分别以10 ml(含15g生药)/kg及10 ml(含30 g生药)/kg灌胃，1次/d，连续给药2周。
       2.3 观察指标
       2.3.1 肠道敏感性测定 给药2周后记录肠道敏感性指标：①直肠内球囊扩张引起腹部抬起、背部拱起的容量阈值。②注水量为1.0 ml时3 min内腹部收缩反射次数。
       2.3.2 标本制备直肠扩张结束1 h后，戊巴比妥纳腹腔注射麻醉，分别取回盲部、距肛门3 cm的结肠及腰椎膨大处脊髓共3处组织，10%中性甲醛固定，常规石蜡包埋，切片(4 μm)。免疫组化染色采用非生物素二步法，组织切片脱蜡至水;枸橼酸盐缓冲液微波修复抗原15 min;加内源性过氧化物酶封闭液10 min;加一抗4℃过夜;加二抗30 min;DAB显色剂镜下控制显色反应时间;苏木素复染。以PBS代替一抗作为阴性对照。
       2.3.3 结果分析 用Image-Pro Plus 6.0病理图像分析系统分析SP、VIP免疫反应阳性纤维的平均光密度值(opacity density，OD)。OD值越大，染色越强。每张切片随机取两个视野分析，取其平均值。
       2.3.4 统计学处理 用SPSS 11.5统计软件处理。所得数据以±s表示，组间差异比较采用单因素方差分析。显著性标准设定α=0.05。
       3 结果
       3.1 肠道敏感性测定结果 模型组大鼠腹部抬起、背部拱起的容量阈值及注水量为1.0 ml时3 min内腹壁反射次数与正常对照组相比均有显著性差异(P<0.01)，说明模型组大鼠肠道敏感性增高。痛泻要方低剂量组、痛泻要方高剂量组和得舒特组最小容量阈值较模型组提高，注水量为1.0 ml时3 min内腹壁反射次数减少，均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。结果见表1。表1 各组大鼠肠道敏感性指标与模型组比较，aP <0.05，bP <0.01;与正常对照组比较，cP >0.05
       3.2 回盲部、结肠及脊髓后角SP表达结果在回盲部、结肠组织中，SP阳性表达主要位于肌间神经丛，呈梭状，神经元密集，呈较强的棕黄色反应(见图1-A，B);在脊髓中，SP能神经元主要分布于后角的Ⅰ，Ⅱ，Ⅴ板层，其余板层也有少量阳性细胞，呈棕黄色至褐色(见图1-C)。模型组回盲部、结肠及脊髓SP阳性表达较正常组显著增高(P<0.01)，而痛泻要方高剂量组各部位SP阳性表达较模型组降低(P<0.05或P<0.01)，与正常对照组相比，差异无显著性(P>0.05)。结果见表2。表2 各组大鼠回盲部、结肠及脊髓SP表达的比较
       3.3 回盲部、结肠及脊髓后角VIP表达结果在回盲部、结肠组织中，VIP神经元主要位于肌间神经丛或直接伸入环形肌层，胞浆及神经纤维均呈较强棕黄色反应(见图1-E，F);在脊髓中，VIP能神经元主要分布于后角的Ⅱ、Ⅴ板层，呈黄色(见图1-G)。在回盲部及结肠组织，模型组VIP阳性表达均较正常组增高(P<0.01)，而痛泻要方高剂量组、得舒特组VIP表达较模型组降低(P<0.05);在脊髓后角，虽然模型组VIP阳性表达较其他各组高，但各组之间无统计学差异(P>0.05)。结果见表3。表3 各组大鼠回盲部、结肠及脊髓VIP表达的比较
       4 讨论
       IBS是由腹部不适或腹痛伴排便异常组成的一组肠功能障碍性综合征，被认为是一种肠动力异常疾病，内脏敏感性增高是IBS最重要的病理生理特征之一[3]。目前认为，肠道轻度炎症[4]、肥大细胞激活[5]等原因导致肠道神经免疫调节异常、外周传入信号放大、中枢信号处理异常，是IBS患者内脏敏感性增高的可能机制。分布于肠道壁的初级感觉神经纤维负责介导各种伤害性感觉的传入，而脊髓背角是内脏感觉传入纤维的会聚处，是肠道与大脑间进行信号传递的中继站。两者是内脏感觉产生的重要神经生理学基础。
       本实验采用新生大鼠持续醋酸灌肠方法复制IBS肠道高敏性大鼠模型，结果显示模型组大鼠腹壁抬起、背部拱起阈值较正常对照组明显降低(P<0.05)，腹壁反射次数增多(P<0.05)，提示模型复制成功。观察发现各剂量痛泻要方与得舒特均能提高腹壁收缩反射阈值，降低内脏敏感性，对模型大鼠有治疗作用。本实验同时选择肠组织与脊髓背角作为观察部位，观察痛泻要方对模型大鼠SP、VIP阳性神经纤维表达的影响，在现有文献中未见有报道。
       SP与VIP分别是兴奋性与抑制性神经递质。SP是速激肽家族成员，在中枢可调节神经元兴奋性;参与调节神经内分泌功能;是伤害性传入纤维末梢释放的兴奋性神经递质。VIP能使全身及内脏血管平滑肌舒张;能刺激多种胃肠激素分泌及胃肠粘膜分泌水和电解质等。本实验结果显示，模型组大鼠回盲部、结肠及脊髓SP反应阳性神经纤维表达均较正常对照组明显增强(P<0.01)，提示SP可能在整合内脏感觉传入中发挥作用。而VIP反应阳性神经纤维仅在回盲部及结肠部位表达增高(P<0.01)，脊髓后角表达无显著性差异(P>0.05)，表明VIP可能仅参与局部肠道平滑肌舒张及胃肠粘膜分泌，又或者在脊髓水平存在负反馈调节，使其表达趋于正常，其确切机制还有待进一步研究证实。痛泻要方能显著减少模型大鼠各部位的SP阳性表达以及回盲部、结肠部位VIP阳性表达，且呈一定量效关系。表明痛泻要方可能通过调节肠道初级感觉神经纤维SP和VIP的分泌，减少伤害性刺激向脊髓后角上传，减弱背角神经兴奋性，从而提高内脏痛阈，降低内脏敏感性。
       许多动物实验及临床证据都证实了痛泻要方在IBS中的治疗作用，在IBS的发生中，神经-免疫-内分泌网络的失调可能涉及多种脑肠肽的变化，痛泻要方是否影响其他脑肠肽的表达，通过何种确切途径起作用，仍需做进一步研究证实。
       【参考文献】
         　　[1] AL-Chaer ED, Kawasaki M, Pasricha PJ. A new model of chronic visceral hypersensitivity in adult rats induced by colon irritation during postnatal development[J]. Gastroenterol, 2000, 119(5): 1276.
       
       [2] 刘雁冰,袁耀宗,陶然君，等.大鼠肠道高敏性模型的建立及其内脏敏感性评估[J].中华消化杂志，2003,23(1):34.
       
       [3] 王伟岸, 钱家鸣, 潘国宗. 肠易激综合征的发病机制[J]. 胃肠病学和肝病学杂志, 2001, 10(2):99.
       
       [4] Spiller RC, Jenkins D, Thornley JP, et al. Increased rectal mucosal enteroendocrine cells, T lymphocytes, and increased gut permeability following acute Campylobacter enteritis and in post-dysenteric irritable bowel syndrome[J]. Gut, 2000, 47(6): 804.
       
       [5] 董文珠,李兆申,邹多武,等. 肠易激综合征患者肠黏膜肥大细胞的光镜和电镜观察[J]. 中华消化内镜杂志, 2003, 20(4): 244.