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       【摘要】 
       目的以光谱技术研究表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和吐温-80(TW-80)对中药有效成分黄芩苷与人血清白蛋白(HSA)的相互作用机制的影响。方法用荧光光谱及紫外光谱技术。结果表面活性剂存在时静态猝灭和非辐射能量转移仍是黄芩苷猝灭HSA内源性荧光的主要原因;CTAB和TW-80存在时，结合常数明显降低，SDS存在时结合常数增加。结论表面活性剂的存在没有改变黄芩苷对HSA内源性荧光猝灭的机理，但使黄芩苷与HSA间的主要作用力由静电作用转化为疏水作用。
       【关键词】  黄芩苷; 人血清白蛋白; 表面活性剂
       血液是一多组分复杂系统，来源于药物制剂中的其它成分必然对药物与血清白蛋白的结合产生某种扰动作用，进而影响药物的分布、转运和贮存形态甚至药物的药效。一些表面活性剂如十二烷基硫酸钠(sodium dodecylsulfate，SDS)、吐温-80(TW-80)等常被用作乳化剂、润湿剂、增溶剂或分散剂等加入药物制剂。因此，研究表面活性剂对药物与蛋白质分子相互作用的影响很有意义。
       中药有效成分黄芩苷分子结构如图1 所示，属于黄酮类化合物，存在于多种植物中，具有抗氧化[1]、预防缺血性脑中风[2]、解热[3]等药理作用。本文运用荧光光谱、紫外光谱等技术，研究了表面活性剂的存在对黄芩苷与HSA相互作用的影响。这对阐明黄芩苷制品在体内的输送和代谢过程具有重要的意义。图1 黄芩苷的分子结构
       1 仪器和试剂
       RF-5301PC型荧光光度计(日本岛津公司);UV-2450PC紫外可见分光光度计(日本岛津公司);人血清白蛋白(HSA，德国Merck公司)，用pH7.40的Tris-HCl缓冲溶液(含0.1 mol·L-1NaCl)配制，其储备液浓度为1.5×10-5mol·L-1，4℃保存;黄芩苷(中国药品生物制品检定所)，储备液(1.0×10-3 mol·L-1)用无水甲醇配制;其他试剂均为分析纯，实验用水均为二次去离子水。
       2 方法
       在3ml含有1.0×10-5mol·L-1HSA溶液的比色皿中，以微量注射器逐次加入不同体积的黄芩苷储备液(累加体积<100 μl)，为了使反应更加完全设定反应时间为5 min。激发和发射光栅狭缝均为5 nm，以280 nm为激发波长，在不同温度下扫描300～500 nm范围内HSA与黄芩苷作用的荧光光谱。
       以Tris-HCl缓冲溶液为溶剂，配制1.0×10-5mol·L-1的黄芩苷溶液，实验温度下恒温测定其300～500 nm的紫外可见吸收光谱。
       2 结果
       2.1 无表面活性剂时黄芩苷与HSA的相互作用
       2.1.1 荧光猝灭机理用黄芩苷滴定HSA溶液的过程中，HSA的荧光被猝灭(如图2)，说明二者发生了相互作用。由图2可见HSA在337 nm处荧光强度随药物浓度增加而逐渐减小，若将此猝灭归因于分子碰撞引起的动态猝灭，则依照Stern-Volmer方程和Ksv=kqT0(kq是双分子动态猝灭速率常数;T0是生物大分子内源性荧光寿命，本文取T0=10-8s[4])得Kq值为1013量级，远大于猝灭剂对生物大分子的最大动态猝灭速率常数(2.0×1010L·mol-1·s-1)，故黄芩苷对HSA荧光的猝灭过程主要为静态猝灭过程[5]。图3中黄芩苷的紫外吸收光谱与HSA的荧光发射光谱有相当程度的重叠现象，据Fφrster无辐射能量转移理论[6]，黄芩苷与HSA之间存在着非辐射能量转移，因此可以判断非辐射能量转移与静态猝灭一样也是导致黄芩苷对HSA荧光猝灭的原因之一。CHSA:1.0×10-6mol·L-1;Cbaicalin /10-6mol·L-1,从上至下: 0, 0.5, 1.0, , 2.0, 3.0, 4.0, 5.0，6.0，7.0图2 黄芩苷与HSA相互作用的荧光猝灭图图3 黄芩苷紫外吸收光谱与HSA荧光发射光谱重叠图
       2.1.2 黄芩苷与HSA的结合常数及结合力类型药物与血浆蛋白的结合是决定药物分布和作用的一个重要因素。根据公式：lg(F0-F)/F =lgKA+nlg[Q]以lg(F0-F)/F 对lg[Q]作图，可得结合常数KA的值(见表1)，反应的结合常数可达105，说明黄芩苷与HAS有较强的结合，可生成黄芩苷-HSA复合物;人血清白蛋白在体内能起到储存和运输药物的作用，使药物通过血液循环达到作用部位,起到治疗的效果。
       为进一步确定黄芩苷与HSA结合的作用力类型，根据van′t Hoff方程求得了热力学参数(见表1)。由ΔG<0，ΔS>0，可知这是一个熵增加、Gibbs自由能降低的自发过程。Ross等[7]认为，ΔS>0是疏水作用的重要特征，而在水溶液中，静电作用过程也表现为ΔS>0，ΔH<0。从作用过程热力学参数来看，ΔH对ΔG总体贡献较大，表明黄芩苷与HSA间疏水作用不是主要的，静电作用为主要作用力。这可能是由于黄芩苷分子中的5-OH与HSA偶极-偶极相互作用的结果。表1 黄芩苷与HSA相互作用的结合参数
       2.2 表面活性剂存在时黄芩苷与HSA的相互作用分别配制含有一定浓度阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)、阳离子表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和非离子表面活性剂吐温-80(TW-80)的HSA标准溶液，其他条件同上，进行实验。3种表面活性剂参与时黄芩苷对HSA的荧光猝灭结果见图4。实验数据按照Stern-Volmer方程处理的结果，由Fφrster无辐射能量转移理论计算得到的r，结合常数KA，有关作用过程的热力学参数计算值一并列于表2。CHSA:1.0×10-6mol·L-1; Cbaicalin/CHSA=1∶11.HSA 2.HSA+SDS 3.HSA+TW-80 4.HSA+CTAB图4 表面活性剂CTAB、SDS和TW-80存在时黄芩苷与HSA相互作用的荧光光谱1.baicalin;2.(1)+TW-80; 3.(1)+SDS; 4.(1)+CTAB图5 表面活性剂与与黄芩苷作用的紫外吸收光谱图　　表2 表面活性剂参与时黄芩苷-HSA结合的实验结果
       由图4可见，表面活性剂存在时黄芩苷对HSA仍具有猝灭作用，表明黄芩苷与HSA之间仍存在相互作用。综合表2中结果可以推断：表面活性剂存在时，黄芩苷对HSA荧光的猝灭机理没有发生改变，静态猝灭和非辐射能量转移仍是两大成因。但表面活性剂的存在影响了黄芩苷与HSA的结合：当CTAB和TW-80存在时，结合常数明显降低，说明阳离子表面活性剂和非离子表面活性剂的参与增加了药物分子的游离浓度，有利于药物快速释放，发挥药效;而当SDS存在时结合常数增加，表明阴离子表面活性剂的参与降低了药物分子的游离浓度，有助于药物持久缓释发挥药效。由热力学函数计算知表面活性剂存在时，黄芩苷与HSA的作用过程仍是一个熵增加、Gibbs自由能降低的自发作用过程，但ΔS>0、ΔH>0表明黄芩苷与HSA间作用力由静电作用为主转变为以疏水作用力为主。
       导致这种结果可能存在以下原因：表面活性剂对蛋白质分子构象的改变和表面活性剂对药物分子的影响。一方面表面活性剂与HSA之间能够相互结合，会导致HSA分子构象发生转变，必然会影响药物-HSA的结合。表面活性剂CTAB和TW-80存在时，改变了蛋白质构象，使蛋白质亲水区色氨酸残基的微环境发生改变，从而色氨酸残基微环境的极性降低，蛋白质扩展，疏水性增强，破坏了静电作用力，使黄芩苷与HSA的相互作用以疏水作用力为主，导致二者的结合减弱，即结合常数减小;当SDS存在时，同样可使色氨酸残基微环境的极性降低，然而结合增强，可能是疏水作用力和静电作用力正协同效应作用的结果[8]。另一方面表面活性剂与药物分子存在一定的相互作用，如图5所示CTAB、SDS和TW-80存在时，黄芩苷的紫外最大吸收峰位置没有明显变化，但最大吸光度有所降低，表明CTAB、SDS和TW-80与黄芩苷也存在一定程度的结合，可能形成了复合物。这种结合势必也会影响黄芩苷与HSA的结合。因此，表面活性剂与黄芩苷的结合及表面活性剂对蛋白质分子构象的破坏影响了黄芩苷与HSA的相互作用。
       此外表面活性剂与药物对HSA同一结合位点可能存在的竞争性结合及表面活性剂对药物在蛋白上结合部位的破坏也可能是影响药物与HSA结合的原因[8]。
       3 结论
       本实验研究结果表明，表面活性剂CTAB、SDS和TW-80的存在没有改变黄芩苷对HSA内源性荧光的猝灭作用，静态猝灭和非辐射能量转移仍然是猝灭形成的两大原因;但表面活性剂的存在影响了黄芩苷-HSA复合物的稳定性，改变了主要结合力的类型，使静电作用力为主转变为疏水作用力为主。这些结果为了解黄芩苷制剂在体内的运输和分布，阐明其作用机制等提供理论依据。
       【参考文献】
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