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       【摘要】 
       目的筛选富集纯化氯化两面针碱的最佳树脂及最佳工艺。方法通过静态吸附-解吸的方法，以氯化两面针碱和总生物碱的吸附率及解吸附率为指标，综合评判确定最佳纯化工艺。结果Ls006树脂对氯化两面针碱的分离效果最好。通过Ls006树脂分离纯化后，终产品中氯化两面针碱的纯度大于90%，保留率达到56.84%。结论采用 Ls006阳离子树脂分离纯化两面针中氯化两面针碱，操作简单，纯化效果突出。
       【关键词】  两面针; 氯化两面针碱; 阳离子树脂; 纯化
       Abstract：ObjectiveTo obtain the optimal conditions for separating nitidine chloride from the extract of Zanthoxylum nitidum by selecting appropriate cation exchange resins.MethodsStatic absorption-desorption method was adopted and separating efficiency was evaluated by cation exchange resins absorption and desorption rates. ResultsThe Ls006 cation exchange resin had the best separating efficiency. After separation and purification， the product purity was over 90%， and the yield of nitidine chloride was up to 56.84%. ConclusionThe Ls006 cation exchange resin can be used for purificating nitidine chloride from Zanthoxylum nitidum， and this method is simple and feasible.
       Key words： Zanthoxylum nitidum; Cation exchange resin; Nitidine chloride; Purification
       两面针Zanthoxylum nitidum (Roxb.) DC.为芸香科花椒属植物两面针的干燥根，现代研究证明两面针具有消肿止痛、抗菌等活性，同时，在抗癌方面有开发价值[1]。其中的氯化两面针碱是两面针制剂的主要有效成分，是两面针及其制剂的主要质量控制指标成分，具有抗肿瘤、强心、降血压、抗真菌作用，特别是抗肿瘤活性方面具有研究价值和开发利用前景[2]。因此，分离纯化两面针中氯化两面针碱具有重大意义。
       目前，对于氯化两面针碱的研究多是提取、含量测定等方面的研究，而在分离纯化方面，仅见黄治勋等将粗结晶活性炭脱色，经甲醇重结晶，得氯化两面针碱。此种方法得到粗结晶前已经做了多步工作，再者活性炭对生物碱有吸附作用[3，4]，最后从两面针根中分得氯化两面针碱的得率很低，仅为 0.149%。王玫馨[5]用氯仿反复研磨两面针甲醇提取液，所得沉淀再经处理得到氯化两面针碱;另外，用氯仿萃取两面针提取物的酸水溶液，回收氯仿，经多步纯化处理也可以得氯化两面针碱，这两种方法均用到氯仿，对环境污染较大，也对生产者健康不利。
       本文采用阳离子交换树脂对氯化两面针碱进行分离纯化。生物碱是一大类碱性含氮化合物，在中性和酸性条件下以阳离子形式存在，能用阳离子交换树脂从提取液中富集分离出来[6]。氯化两面针碱是叔胺类生物碱，碱性较弱，与用强酸性阳离子交换树脂效果会更好。本实验采用氯化两面针碱转移率较高的提取溶剂进行提取，以氯化两面针碱和总生物碱的吸附率及解吸附率为指标，对4种不同型号的树脂的分离纯化效果和解吸附条件进行了研究，与液-液分配等纯化方法相比，该方法不仅省时省力，操作简单，而且还可以节约大量的有机溶媒，最后纯化效果突出，回收率也较高。
       1 材料与仪器
       1.1 材料和试药氯化两面针碱对照品(中国药品生物制品检定所，批号：848-9901)，两面针总生物碱对照品(本实验室制备。经HPLC分析，氯化两面针碱含量≥60%)，两面针药材(广西南宁药材市场，广西中医药研究院赖茂祥研究员鉴定为两面针Zanthoxylum nitidum);阳离子树脂Ls006，Ls008(西安蓝深树脂有限公司)，Lx-10(西安蓝晓有限公司)，732(南宁市松源仪器化玻有限公司);95%乙醇，盐酸，氢氧化钠，氯化钠，甲醇，等均为分析纯(汕头市西陇化工厂有限公司)，蒸馏水，去离子水(自制)。
       1.2 仪器LC-10AT VP高效液相色谱仪(日本岛津);SPD-10A VP紫外检测器(日本岛津);N2000色谱工作站(浙江大学智达信息工程有限公司);TU1800紫外可见分光光度计(北京普析通用公司);SB超声波清洗器(上海Branson);LXJ-Ⅱ离心沉淀机(上海医分仪器制造有限公司);AL204101型电子天平(Mettler Toledo Group);调速多动振荡器HY-4(国华电器有限公司) 。
       2 方法
       2.1 总生物碱含量测定以两面针总生物碱对照品为对照，参照文献[7]的UV测定方法，得两面针总生物碱的含量测定回归方程为Y= 0.078 7 X-0.007 6，r=0.999 9，结果表明两面针总生物碱在0.51～10.20 μg·ml-1与吸光度呈良好线性关系。
       2.2 氯化两面针碱含量测定色谱柱为Hypersil BDS C18(4.6 mm × 25 mm， 5 μm)，流动相为乙腈-水-磷酸-三乙胺(25∶75∶1∶1)为流动相，检测波长为271 nm，流出速度为1 ml·min-1，柱温为30 ℃。参照文献[8]的测定方法，以氯化两面针碱对照品为对照，得氯化两面针碱的含量测定回归方程为：Y= 600 87 X+159 64，R2=0.999 9，线性范围2.2～44 μg·ml-1。
       2.2 两面针提取溶液的制备两面针药材用60%的乙醇溶液提取3次，用量依次分别是6倍量、5倍量和4倍量(60%乙醇溶液对两面针药材的体积重量比)，回流提取时间依次分别为2.0，1.5，1.5 h，回流结束后，过滤，合并3次滤液，备用。
       2.3 离子交换树脂的预处理树脂用去离子水在70 ℃左右洗涤(7次～8次)至无味或洗出水无色，然后用3.0 BV 1.0 mol·L-1 HCl洗脱，然后用3.0 BV 5% NaCl洗脱，接着用3.0 BV 1 mol·L-1 NaOH洗脱然后用去离子水洗脱至pH为9.0，接着用3.0 BV 1 mol·L-1 HCl洗脱，最后去离子水洗脱至pH为6.0，整个过程中流速为1.0 BV·h-1，处理完后备用。
       2.4 吸附量和解吸附率的测定精密称取经预处理的湿树脂1.0 g，置于100 ml的具塞磨口的锥形瓶中，加一定浓度生物碱溶液50 ml，于室温下摇床振荡吸附24 h后，测定总生物碱的浓度，滤去药液，用去离子水洗至无混浊，然后再加解吸剂50 ml，摇床振荡24 h，充分解吸附后测定解吸液的总生物碱浓度。Q = (C0-C) V/W①E(%)= CVb/Q×100%②式中Q为吸附量(mg·g-1)，C0为初始浓度(mg·ml-1)，C为吸附后溶液浓度(mg·ml-1)，V为溶液体积(ml)，W为树脂质量(g);E%为解吸率;C为解吸附溶液中总生物碱的质量浓度(mg·ml-1);Vb为解吸附溶液的体积(ml)。
       3 结果
       3.1 树脂的筛选 在相同条件下，按照“2.4”方法测定4种树脂对总生物碱的静态吸附量和解吸率以及氯化两面针碱的转移率。结果见表1。表1 4种树脂的静态吸附容量和解吸率从表1可见，Ls006树脂对总生物碱的静态吸附容量和静态解吸率以及氯化两面针碱的解吸率均为最大，所以选择Ls006作进一步研究。由于HPLC测定结果显示用Ls006树脂吸附时，氯化两面针碱的泄露率仅为1.5%，即氯化两面针碱的吸附率已经很高，所以不对上样条件进行优选。
       3.2 解吸附剂的选择被吸附在树脂上的总生物碱成分可用酸性和碱性的溶媒进行解吸附。本实验对盐酸、盐酸-乙醇、氨水-乙醇这3种解吸附体系进行了比较研究后，还比较了不同浓度的盐酸和乙醇的酸性乙醇溶液的解吸附效果。经试验表明，解吸附效果为氨水-乙醇﹥盐酸-乙醇﹥盐酸，但是由于曾有文献[9]报道氯化两面针碱在有氧存在的碱性条件下容易反应成为氧化两面针，故选择盐酸-乙醇体系作为解吸附剂。在相同条件下，将吸附饱和的树脂分别用表2中列出的不同盐酸和乙醇浓度的溶液解吸附，计算总生物碱解吸率。实验发现，当树脂上未解吸附的总生物碱太多时，将会降低树脂的再次吸附量和重复使用次数，并且氯化两面针碱的解吸率也随着总生物碱解吸率增大而增大，为简便起见，以总生物碱解吸率为指标选择解吸附剂即可。结果见表2。
       由表2可见，解吸附剂中盐酸含量在3.0～4.0 mol·L-1，乙醇含量在60%～80%时解吸附效果较好。为了得到一个最优的解吸附剂组成，再各取1.0 g吸附饱和的树脂3份，分别加入50 ml 3.0 mol·L-1 HCl 70% EtOH，3.5 mol·L-1 HCl 65% EtOH，4.0 mol·L-1 HCl 61 % EtOH进行静态解吸附，测定总生物碱含量，计算解吸率。结果，用50 ml 3.0 mol·L-1 HCl 70% EtOH的解吸率最高，为96.61%。表2 不同解吸液的总生物碱解吸率
       3.3 解吸附剂用量的确定取吸附饱和的树脂用3.0 mol·L-1 HCl 70% EtOH溶液进行解吸附，2.0 BV/次，摇床振荡12 h后滤去解吸液，再加入新的2.0 BV解吸液，直到大部分生物碱被解吸附，测定每次滤液的总生物碱和氯化两面针碱的含量，求解吸附率。结果见图1。图1 解吸附剂用量考察由图1可见，随着解吸液体积的增加，解吸率逐渐增大;当解吸液体积为14.0 BV时，氯化两面针碱的解吸率达70%以上，总生物碱的解吸率达到90%以上，随着解吸液体积倍数的继续增加，氯化两面针碱的解吸率增加幅度明显减小，综合考虑回收率及生产成本，确定解吸液用量为14.0 BV。
       3.4 最佳工艺重复性实验将上样液加到放有20 g树脂的试剂瓶中，室温下摇床振荡吸附24 h后，过滤，水洗树脂至水洗液无色，然后加解吸液进行解吸附，解吸液2.0 BV/次，摇床振荡12 h后滤去解吸液，再加入新的2.0 BV解吸液，合并滤出的解吸液，并2 000 r·min-1离心，得到沉淀，测得其中氯化两面针碱含量为92%。
       3.5 产品分析产品减压干燥后，精密称取5.1 mg于10 ml容量瓶，用甲醇定容后超声溶解30 min，备用。
       3.5.1 薄层色谱定性[10]精取产品溶液200 μl加甲醇稀释成1 ml，吸取5 μl点于薄层板上，并以氯化两面针碱对照品液为阳性对照，以苯-醋酸乙酯-甲醇-异丙醇-浓氨试液(20∶5∶3∶1∶0.12)为展开剂，展开缸中饱和10 min，展开，取出，晾干，置紫外灯(365 nm)下检视。结果，沉淀样品除显示与氯化两面针碱对照品相同的亮黄色斑点外，有时尚显示1个暗淡的黄色斑点。
       3.5.2 HPLC定量测定分别取提取液20 μl，泄露液200 μl，产品溶液50 μl，然后均用甲醇分别稀释成1.0 ml，0.45 μm微孔滤膜过滤，超声除气泡30 min后，取20 μl进样，测定。沉淀产品中氯化两面针碱含量达92%。
       4 结论
       通过对4种阳离子脂树的静态吸附研究发现，Ls006型阳离子树脂树脂是比较理想的树脂，吸附率大，解吸附率高，操作简便， 较适合两面针中氯化两面针碱的分离纯化。Ls006树脂吸附饱和后，用3.0 mol·L-1 HCl 70% EtOH溶液进行解吸附效果最佳，解吸附剂用量为14.0 BV，2.0 BV/次， 摇床振荡12 h后滤去解吸液，再加入新的解吸液。最后氯化两面针碱的解吸率达70%以上，总生物碱的解吸率达到90%以上。经分离纯化后产品为深黄色粉末，HPLC分析氯化两面针碱纯度达90%以上，保留率为56.84%，具有潜在的工业应用价值。
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