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       【摘要】 
       目的研究溶剂提取法从迷迭香中提取熊果酸的最佳工艺。方法首先采用单因素实验，以熊果酸提取率为评价指标，采用溶剂提取法研究提取工艺，并通过正交实验，对过程参数进行优化。同时采用比色法和高效液相色谱法分别对提取物中熊果酸进行定性、定量分析。结果乙醇提取最佳工艺为乙醇体积分数90%，料液比1∶20，提取温度80℃，提取2次，每次3h，熊果酸提取率可达92.38%。结论建立的数学模型和优化结果合理，溶剂法提取熊果酸可行。
       【关键词】  迷迭香; 熊果酸; 溶剂提取法
       Abstract：ObjectiveTo study the optimal extraction process for ursolic acid from Rosmarinus officinalis.Methods The extraction was studied by using single-factor and orthogonal experiment guided by the extraction rate of ursolic acid. Colorimetry was adopted to conduct qualitative analysis and high performance liquid chromatography (HPLC) was used to determine ursolic acid content. ResultsThe optimal extraction process was as follows：ethanol concentration 90%,material to solvent 1∶20,extraction temperature 90℃, extraction time 3h，the extraction rate of ursolic acid could get to 92.38%.ConclusionThe established model and optimized results are proved to be　reasonable and the extraction process is feasible.
       Key words：Rosmarinus officinalis; Ursolic acid; Extraction process
       迷迭香Rosmarinus officinalis L.系唇形科迷迭香属植物，是目前公认的具有较高抗氧化作用的一种植物[1]，它具有消除胃胀气、增强记忆力、提神醒脑、降低血糖、治疗风湿痛等功效[2]。迷迭香中的化学成分复杂，目前研究较多的抗氧化成分主要为迷迭香酚、表迷迭香酚、异迷迭香酚、迷迭香酸及黄酮等成分[3]。熊果酸(Ursolic acid,UA)具有抗肿瘤、抗肝炎、降血脂、抗动脉粥样硬化、抗糖尿病、抗HIV、抗寄生虫等作用[4]，其结构复杂，尚无合成品，主要靠从植物中提取获得[5]。从迷迭香中提取熊果酸未见有关报道。本实验采用溶剂提取法对迷迭香中熊果酸的最佳提取工艺进行了研究，同时采用高效液相色谱法准确对提取物中熊果酸进行定量，为充分利用迷迭香资源提供科学依据。
       1 材料
       干制迷迭香，由海南万恒生物有限公司提供;熊果酸标准品，中国药品生物制品检定所;甲醇为色谱纯，水为超纯水;无水乙醇、香草醛、高氯酸、乙酸均为分析纯，广州化学试剂厂出品。高效液相色谱Jasco-1586(双泵)，UV-1570紫外检测器;CO-1560柱箱;LEO超声波清洗器，大连华洋科技仪器有限公司产品;PPENDORF微量移液器(德国);旋转蒸发仪，德国Heidolph LABOROTA 4000;UV-2450紫外可见分光光度计，日本岛津株式会社公司产品。
       2 方法
       2.1 迷迭香中熊果酸的定性—高氯酸-香草醛法 精密称取熊果酸标准品4.7 mg，置于10 ml容量瓶中，甲醇溶解，稀释至刻度，作为对照品溶液。用微量移液器移取对照品溶液1.00 ml于10 ml容量瓶中，于100℃烘箱中烘干后，冷却后加入0.5 ml 5%香草醛和0.8 ml高氯酸，在60℃水浴保温10 min，冷却后加乙酸溶解并稀释至刻度，摇匀，在546 nm处测定吸光度。
       2.2 熊果酸的含量测定
       2.2.1 高效液相色谱法测定条件 色谱条件：色谱柱为Symmetryshield RP18 (3.9 mm×150 mm,5 μm);流动相为0.2%磷酸二氢钠-甲醇(14∶86);流速为0.8 ml/min;检测波长为210 nm;灵敏度为0.16 AFUS;柱温为室温(25 ℃)。
       2.2.2 供试品溶液的制备 称取迷迭香粉末适量，按L9(34)正交实验表所列进行提取，提取过程保持溶剂回流状态，过滤或抽滤除渣，减压回收乙醇，得浸膏，将浸膏依次用石油醚、氢氧化钠水溶液、水洗至洗出液近无色，烘干。再用无水乙醇加热溶解，加活性炭回流脱色，过滤。用热乙醇反复洗涤残渣，合并滤液及洗液，蒸去部分乙醇，放冷，静置，得白色片状结晶提取物。精密称取提取物100.0 mg于10 ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，作为供试品溶液。
       2.3 测定 吸取上述对照品溶液和供试品溶液，经0.45 μm微孔滤膜过滤，在上述色谱条件下进样20 μl进行分析，根据HPLC色谱图中的峰面积，按外标法定量，计算出样品中熊果酸的含量和提取率。
       3 结果与讨论
       3.1 单因素实验结果分析
       3.1.1 提取溶剂的选择 称取迷迭香粉2.0 g，分别用甲醇、乙醇、醋酸乙酯、丙酮作溶剂，以1∶25的料液比，在60℃水浴中提取2 h，按“2.1”项进行测定。结果见表1。由表1可以看出最佳的提取溶剂是乙醇。虽然丙酮的吸光度较大，但因为丙酮有毒，生产工艺要求较高，所以不选择丙酮作提取溶剂。表1 不同提取溶剂对提取效果的影响
       3.1.2 乙醇浓度的选择 称取迷迭香粉2.0 g，分别用30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%乙醇50 ml，在60℃水浴中提取2 h，按“2.1”项进行测定。结果见表2。从表2可以看出随着乙醇浓度的增加，提取物的吸光度逐渐升高，说明提取出来的熊果酸在增加。其可能原因是随着乙醇浓度的增大，乙醇溶液的极性也逐步减弱，而熊果酸又属于五环三萜类非极性物质，根据相似相溶原理，熊果酸易溶于纯的乙醇溶液中。为了回收溶剂方便，选择乙醇的最佳提取浓度为90%。
       3.1.3 料液比的选择称取迷迭香粉2.0 g，用90%乙醇分别配制1∶10，1∶15，1∶20，1∶25料液比(g/ml)，在60℃水浴中提取2 h，按“2.1”项进行测定。结果见表3。表2 乙醇浓度对提取效果的影响表3 物料比对提取效果的影响从表3可见，随着溶剂量的增加，提取物的吸光度逐渐升高，到20倍量以后基本持平。由于料液比增加，会给后处理工序增加困难，而且增加生产成本，在保证提取效果的同时，应尽量减少溶剂用量和降低蒸发浓缩负荷，因此选择最佳料液比为1∶20。
       3.1.4 提取时间的选择 称取迷迭香粉2.0 g，用90%乙醇溶液，以1∶20的料液比，在60℃水浴中提取1，2，3，4，8 h，按“2.1”项进行测定。结果见表4。表4 提取时间对提取效果的影响
       3.1.5 提取温度的选择 称取迷迭香2 g，用90%乙醇溶液为溶剂，以1∶20的料液比，在55，60，65，70，75，80，90℃水浴中提取4 h，按“2.1”项进行测定。结果见表5。
       随着温度的升高，溶剂的粘度减小，分子运动速度加快，浸提液的扩散系数增加，促使浸提速度加快。从表5可以看出，随着温度的提高提取物的吸光度也平缓增加，到90℃吸光度下降，可能是因为乙醇在80℃左右沸腾，在接近沸点时提取温度太高，杂质的溶出量增加而受到影响。所以最佳的提取温度为80℃。表5 提取温度对提取效果的影响
       3.2 正交实验结果分析以不同提取工艺条件下迷迭香中熊果酸的含量为指标，以单因素各影响因子为研究对象，进行L9(34)正交实验。结果见表6。表6的结果说明，各因素对迷迭香酸提取效果的影响程度依次为B>A>D>C，因素C、D无显著性差异，这说明提取温度和提取时间在正交设计的4水平内对迷迭香酸的含量无显著性影响，而提取时间太长会延长操作周期，对生产不利。因素A、B有显著性差异，说明料液比和乙醇浓度对迷迭香酸的含量有很大的影响，综合各因素的k值和直接比较，A3B3C2D1为最佳提取条件。即料液比1∶20，溶剂比为90%的乙醇溶液，提取温度80℃，提取时间3h。表6 正交实验结果
       3.3 提取次数的选择通过正交实验得到一个最佳提取工艺条件的组合，按此组合，分别提取1，2，3，4次，以迷迭香酸的提取率为检测指标，考察提取次数对提取工艺的影响，每个实验重复做3次，结果见表7。从表7可以看出，2次提取就可将大部分迷迭香酸提出，提取率达92.38%，再增加提取次数，提取率提高不明显。从经济角度考虑，本实验采用2次提取。表7 浸提次数对提取率的影响
       4 结论
       结合单因素和正交实验的结果，得出迷迭香中熊果酸酸的最佳提取工艺是：料液比1∶20，溶剂比为90%的乙醇溶液，提取温度80℃，提取时间3 h，浸提两次。在最佳条件下熊果酸的提取率为92.38%。
       【参考文献】
         　[1] 刘士德,佘玉雯,张建华，等.迷迭香抗氧化提取物的应用研究[J].食品科技,2003,2:59.
       
       [2] Chen JH, Ho CT. Antioxidant activities acid and its related hydroxycinnamic acid compounds[J].J Agric Food Chem, 1997,45(7):2374.
       
       [3] 韩宏星,宋志宏,屠鹏飞.迷迭香水溶性成分研究[J].中草药, 2001, 32 (10): 877.
       
       [4] William H, William BL. Inhibitors of human immunod efficiency Vrus typel reverse transcriptase target distinctphasesofearly reversetranscription[J]. Journal of virology, 2001, 75:3095.
       
       [5] 王 鹏,张忠义,吴 忠.熊果酸在药用植物中的分布及药理作用[J].中药材,2000,23(11):717.