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       【摘要】 
       目的观察三叶青黄酮对SMMC-7721肝癌细胞诱导凋亡的作用。方法通过四氮噻唑蓝(MTT)比色法检测三叶青黄酮对细胞的抑制增殖作用;光学显微镜、荧光显微镜下形态学观察;DNA琼脂糖凝胶电泳及流式细胞仪(FCM)研究分析三叶青黄酮对肝癌细胞的诱导凋亡作用。结果三叶青黄酮能显著的抑制SMMC-7721肝癌细胞的生长，并具有浓度依赖性。光学显微镜、荧光显微镜下观察,发现细胞凋亡现象;DNA琼脂糖凝胶电泳可见DNA梯形条带;流式细胞仪(FCM)检测分析出现凋亡亚二倍体峰。结论三叶青黄酮对肝癌细胞具有诱导凋亡作用,有抗肝癌的药用价值。
       【关键词】  三叶青黄酮; 肝癌细胞; 凋亡
       三叶青具有清热解毒、祛风化痰、活血止痛等功效[1]，用于治疗高热惊厥、肺炎、哮喘、肝炎、风湿、月经不调及恶性肿瘤，具有很好的疗效。大量的研究表明该中药具有免疫调节作用 , 其不仅直接作用于细胞免疫，而且通过整体作用来控制细胞免疫与细胞因子的活动。近几年，三叶青黄酮抗肿瘤作用日益受到重视。为进一步探讨三叶青抗肿瘤作用的机制，更好地开发利用三叶青， 本实验通过(MTT)比色法、光学显微镜下形态学观察、荧光显微镜观察、DNA琼脂糖凝胶电泳、流式细胞仪(FCM)测定法研究三叶青黄酮对SMMC-7721肝癌细胞诱导凋亡进行研究。
       1 仪器与材料
       1.1 仪器酶联免疫检测仪，国营华东电子管厂研制，型号，DG-3022;流式细胞仪(FCM)，美国B&D公司产品，型号，FACS.calibur;电泳仪，北京六一仪器厂产品，型号DYY-Ⅲ1;紫外透射分析仪，上海长兴机器厂产品，型号: 2F-3。
       1.2 药物与试剂三叶青，宁夏明德饮片厂提供，宁夏药品检验所鉴定。青霉素，宁夏启元药业生产，规格，160万单位，批号080912;链霉素，安徽淮南国瑞药业产品，规格，0.75 g，批号20090308;RPMI1640，美国Sigma公司产品;四氮噻唑蓝(MTT)，美国Sigma公司产品。
       1.3 细胞株及培养肝癌细胞株SMMC-7721由第四军医大学口腔医学院引进。接种于100 L玻璃培养瓶中，在含10%小牛血清、青霉素100 mg·L-1、链霉素100 mg·L-1的RPMI1640培养基中， 37℃、pH7.2置5%CO2培养箱中培养48 h，经0.25%的胰酶消化后，制成2×105·ml-1细胞悬液。
       1.4 三叶青黄酮的提取、分离和制备称取三叶青块根1 000 g ，采用碱性稀醇提取法[2] 提取得三叶青黄酮7.2 g 。聚酰胺柱层析[2] 后，分别用10% ，30% ，50% ，70% ，95% 的乙醇洗脱，回收得浓缩物，真空干燥至恒重，分别标记为HT10，HT30，HT50，HT70 和HT95。分别称取HT10，HT30，HT50，HT70 和HT95各2 mg ，溶解于200 μl 二甲基亚砜中，旋涡振荡，全部溶解后，加入800 μl RPMI1640培养液旋涡震荡混匀后放置于4 ℃ 冰箱保存备用， 终浓度为10 mg ·ml-1 。用时按比例配制成2，4，6，8，10 mg ·ml-1的浓度液。
       2 方法
       2.1 实验分组实验组分加药组和对照组,加药组分别加入HT10，HT30，HT50，HT70 和HT95。各自加入100 μl 2，4，6，8，10 mg ·ml-1的药液，每计量组6个复空，对照组加等量的培养基,混匀后放入5%CO2培养箱中培养。
       2.2 四氮噻唑蓝(MTT)比色法取对数生长期SMMC-7721细胞,接种于96孔板,每孔加入100 μl细胞悬液,培养24 h,待细胞贴壁后,进行换液和药物处理[3] ,弃上清液,加入100 μl HT10，HT30，HT50，HT70 和HT95各浓度的药液100 μl。对照组加100 μl的培养液，混匀。37℃、pH7.2置5%CO2培养箱中培养。培养48 h后,弃上清液,在各孔中加入5 g·L-1MTT 30 μl ,继续培养4 h,弃上清液,每孔加二甲亚砜100μl,振摇5 min,用酶联免疫检测仪测定570 nm处吸光度,计算出细胞抑制率。
       2.3 光学显微镜下形态学观察取实验组细胞,用PBS(pH7.2)洗涤1次,做离心涂片,用甲醇固定3～5 min，滴加Wright染色2 min,入Wright磷酸缓冲稀释液4～10 min，用蒸馏水冲洗[3] ,在油镜下观察细胞形态。
       2.4 荧光显微镜观察取实验组细胞,吹打均匀,取30 μl悬液加到载玻片上,加10 μl吖啶橙染色,加盖玻片后置荧光显微镜下观察SMMC-7721细胞形态并照相,在显微镜下数400个细胞,计算细胞凋亡率[3]。
       2.5 DNA琼脂糖凝胶电泳收集药物作用组及对照组培养细胞,常规方法提取细胞DNA ,1.5%琼脂糖凝胶孔中电泳,在室温、50 V、恒流60 mA电泳2 h,紫外灯下观察并照相[3]。
       2.6 流式细胞仪(FCM)分析将经药物处理的细胞，1 000 r·min-1离心5 min，弃上清液，PBS洗涤2次，1 000 r·min-1离心5 min，弃上清液，加冷的70%(体积分数)乙醇4℃固定24 h，离心，弃乙醇，PBS洗1次，1 000 r·min-1离心5 min，弃上清液，滴加0.5 ml 100 mg·L-1RNase，放置4 h，离心，弃上清液，PBS洗1次，300目筛网过滤1次， 1 000 r·min-1离心5 min，弃上清液，加0.5 ml PI过夜[3]。上流式细胞仪测定。
       2.7 统计学处理采用SPSS11.0 软件,不同药物浓度组间的比较采用完全随机设计的方差分析,各药物浓度组与对照组的比较采用Dunnett t 检验,以α= 0.05 为检验水准。
       3 结果
       3.1 三叶青黄酮对SMMC-7721肝癌细胞增殖的抑制作用结果见图1。从图1可以看出,不同浓度乙醇层析分离的三叶青黄酮(HT10、HT30、HT50、HT70和HT95) 均能抑制SMMC-7721 细胞的增殖;随着药物浓度的增加,其生长抑制作用增强,呈浓度-效应关系。其中HT50作用最强,随着加入药物浓度的增加,其对SMMC-7721细胞生长抑制率分别为38.6%，47.2%，65.1%，70.1 %和71.6%。图1 三叶青黄酮对SMMC-7721肝癌细胞增殖抑制作用
       3.2 光学显微镜下形态学变化取对照组细胞及实验组细胞，光学显微镜下观察,可见实验组细胞染色质浓集,细胞核固缩、碎裂,细胞膜起泡,有核碎片的凋亡小体形成。
       3.3 荧光显微镜下形态学变化取对照组及实验组细胞,荧光显微镜下可见对照组细胞为黄色或桔红色,给药组细胞核或细胞质内可见致密浓集的黄绿色染色,可见黄绿色碎片,细胞核固缩、核碎裂、细胞膜起泡及凋亡小体形成,检测其凋亡率, 其中HT50组不同浓度的凋亡率分别为29.5%，36.3%，52.5% ，62.8%和70%;随着浓度的不断增加,细胞凋亡率呈上升趋势。
       3.4 DNA琼脂糖凝胶电泳结果取对照组及HT50组的8，10 mg ·ml-1两个浓度的细胞,经琼脂糖凝胶电泳后,给药组均出现凋亡特有DNA Lad-der带,而对照组则无此带。3.5 流式细胞仪(FCM)测定结果取对照组及HT50组的8，10 mg ·ml-1两个浓度的细胞,流式细胞仪(FCM)测定,对照组未出现亚2倍体峰,给药组均可见明显的亚2倍体峰。
       4 讨论
       三叶青具有多方面的生物活性,其中抗肿瘤作用日渐被人们重视。本研究通过定量和定性的细胞凋亡研究方法，对5种不同浓度的乙醇分离的三叶青黄酮作用后的细胞进行凋亡研究，发现各组均有直接抑制肿瘤细胞增殖作用，且呈浓度-效应正相关。其中HT50的10 mg ·ml-1浓度抑制作用最强。通过光学显微镜、荧光显微镜对细胞形态学的观察,可见细胞核固缩、核碎裂、细胞膜起泡及凋亡小体形成等形态, 随着浓度的增加凋亡率也不断升高。 DNA琼脂糖凝胶电泳显示实验组细胞,DNA电泳图上呈现“梯状”条带,这是细胞凋亡最具特征的生化改变;流式细胞仪分析,三叶青黄酮作用后的细胞均出现明显的亚2倍体峰。三叶青黄酮对SMMC-7721肝癌细胞具有明显的诱导凋亡作用,是很有潜力的抗癌药物。
       【参考文献】
         　[1] 中国医学科学院药物研究所，北京医学院，南京药学院，等. 中药志(第2册) [M]. 北京:人民出版社，1984:219.
       
       [2] 肖崇厚. 中药化学[M]. 上海:上海科学技术出版社，2000:265.
       
       [3] 姜 泊，周殿元.细胞凋亡基础与临床[M].北京:人民军医出版社，1999：258，263，266，285.