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       【摘要】 
       目的研究南海大型经济海藻带形蜈蚣藻(Grateloupia turuturu)的化学成分。方法利用色谱、 红外、质谱和核磁共振波谱等方法对带型蜈蚣藻的化学成分进行分离和结构鉴定并进行抗病毒活性研究。结果从中分离鉴定了6个化合物，分别为棕榈酸(I)、3-β-5-烯-胆甾醇(Ⅱ)、胆甾-4-烯-6-酮(Ⅲ)、胆甾-4-烯-3-酮(Ⅳ)、胆甾-4，6-二烯-3-醇(Ⅴ)和胆甾-4，6-二烯-3-酮(Ⅵ)，化合物Ⅱ抗HSV-1病毒效果较好，其IC50达到7.81μg/ml。结论以上均为首次从该海藻中分离得到。化合物Ⅱ具有较好的抗病毒活性。
       【关键词】  带型蜈蚣藻; 化学成分; 抗病毒活性; HSV-1
       海藻生存在海洋高压、高盐、少光、少氧等特殊的环境中，其次生代谢产物往往具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤方面的活性[1，2]。我国有经济价值的海藻一百多种，主要为褐藻、红藻、绿藻及少量蓝藻等大型种类。南海大型经济海藻带形蜈蚣藻Grateloupia turuturu Yamada属于红藻门、真红藻纲、隐丝藻目、海膜科、蜈蚣藻属[3]。目前已知的蜈蚣藻属海藻有31种，自20世纪50年代就开始对该属海藻进行了化学成分和生物活性方面的研究，从中分离分析出的化合物主要为氨基酸、脂肪酸、甾醇、糖苷等[4～9]。但对带形蜈蚣藻化学成分及生物活性的研究还很少见文献报道[10，11]。本文对带型蜈蚣藻醇提物进行分离分析，并对分离获得的单体化合物进行抗病毒活性研究，希望对深入开发利用海藻资源提供理论依据。
       1 材料
       1.1 样品来源带形蜈蚣藻全藻，采集自广东南海南澳岛，由中国科学院海洋研究所夏邦美、丁兰平教授鉴定，现保存在中科院青岛海洋研究所海藻标本室。
       1.2 试剂95%乙醇，广州化学试剂厂;柱层析硅胶，薄层层析硅胶(HF254)，青岛海洋化工有限公司;葡萄糖凝胶(Sephadex LH-20)，Pharmacia公司;其他试剂均为分析纯。阿昔洛韦(Acyclovir, ACV)，湖北科益药业股份有限公司;病毒唑(Ribavirin injection)，广州市市桥药业有限公司;DMEM培养液，Hyclone;胎牛血清，Gibco公司产品;其它试剂均为分析纯。
       1.3 仪器RE-52CS三用紫外线分析仪，上海嘉鹏科技有限公司;XT-6型 熔点测定仪(温度未校正)，北京泰克仪器有限公司;EQUINOX-55型红外光光谱仪，德国BRUKER公司; Trace QC-trace MS型气-质联用仪，美国Finnigan公司;BRUKER DRX-400型核磁共振仪，德国BRUKER公司;AB-ZHS型质谱仪，英国VG公司。酶标仪，美国BIO-RAD公司。
       1.4 实验采用的病毒及对应的宿主细胞柯萨奇病毒(CVB3),武汉大学医学院病毒研究所提供;宿主细胞为人宫颈癌HeLa细胞。单纯疱疹病毒I型(HSV-1，F株，美国ATCC VR733);宿主细胞为非洲绿猴肾细胞(Vero,美国ATCC CCL81)。
       2 方法
       2.1 样品的提取分离带形蜈蚣藻全藻(干重5kg)。用95%乙醇室温浸提3次。减压浓缩后依次用石油醚、醋酸乙酯和正丁醇进行萃取，石油醚层粗提物过常压硅胶柱，石油醚/醋酸乙酯体系梯度洗脱后，石油醚∶醋酸乙酯为9∶1和7∶3部分用常压硅胶柱层析和凝胶柱色谱Sephadex LH-20分离纯化，得化合物I、II。石油醚:醋酸乙酯为2∶8洗脱时出现白色晶体，用凝胶柱色谱Sephadex LH-20分离纯化，得一混合物。
       2.2 抗病毒活性实验
       2.2.1 样品母液的配制称取化合物I棕榈酸、化合物II3-β-5-烯-胆甾醇各4 mg溶于100 μl DMSO和1 900μl DMEM中。将上述6样品配成2 mg/ml原始液，滤膜除菌，备用。
       2.2.2 MTT法测定样品对细胞的毒性将终浓度为2.5×105/ml的细胞接种于96孔细胞培养板上，置于37℃、5% CO2培养箱中，待细胞长成单层后，弃去培养液，将样品溶液用维持液对倍稀释成不同浓度，加入96孔板中，每孔加100 μl，每个稀释度平行作四孔, 置于37℃、5% CO2培养箱中培养48 h后，每孔加入5mg/ml的MTT 10 μl，继续培养4 h后，弃MTT液，每孔加入浓度为10%的SDS 100 μl,置于37℃,5% CO2培养箱中，过夜。用酶标仪测OD值(测量波长为570 nm,参比波长为630 nm),求出样品液对细胞的半毒性浓度(50%cytotoxic concentration ,CC50 , μg /ml)和无毒界限浓度(maximal non-cytotoxic concentration ,MNCC)。细胞存活率%=试验孔OD值/细胞对照孔OD值×100%[12]。
       2.2.3 样品对由病毒感染引起细胞病变的抑制作用将终浓度为2.5×105/ml的细胞接种于96孔细胞培养板上，置于37℃,5% CO2培养箱中，待细胞长成单层后，弃去培养液，同时加入50 μl 100 TCID50的病毒悬液和50 μl以不超过MNCC为最高浓度对倍稀释后的样品溶液，同时设正常细胞对照组、病毒对照组和阳性对照组。96孔细胞培养板置于37℃、5% CO2培养箱中，每天在显微镜下观察由病毒引起的CPE(“-”为0%CPE;“+”为1～24%CPE;“++”为25～49%CPE;“+++”为50～74%CPE;“++++”为75～100%CPE)。当病毒对照组出现“++++”时，记录各孔的CPE，求出各样品对细胞病变的半抑制浓度(50% inhibited concentration,IC50, μg /ml)和选择指数(selectivity index, SI=CC50/IC50)[13,14]。
       3 结果
       3.1 化合物的物理性质和波谱数据
       3.1.1 化合物I白色脂状固体，重量：897 mg;m.p.：59.5～60.4℃;IRυKBRmax(cm-1)：3 437.93，2 917.65，2 849.46，1 698.88，1 645.72，1 411.78，1 294.61，1 228.02，1 100.41;1HNMR(δ:ppm，CDCl3，TMS): 2.36 (2H，t，2-H)，0.92～1.28(24H，3～14-H)， 1.65 (2H，m，15-H)， 0.9 (3H，t，16-H);EIMS(m/z)：256，213，157，129，73，60。参考文献[15]，确定结构为棕榈酸。
       3.1.2 化合物Ⅱ白色针状晶体，重量：165.5 mg;m.p.：146.5～146.7℃;Liebermann-Burchard 反应呈阳性;IRυKBRmax(cm-1)：3 440.21，2 933.18，2 866.79，1 645.38，839.5;1HNMR (δ：ppm，CDCl3，TMS)： 5.33(1H，s，6-H)，3.5(1H，m，3-H)，0.98(3H，s，19-H)，0.66(3H，s，18-H);13CNMR(δ:ppm, CDCl3, TMS)：140.8(C-5)，121.7(C-6)，71.8(C-3)，56.8(C-14),56.1(C-17)，50.1(C-9)，42.3(C-4，13)，39.8(C-12)，39.5(C-24)，37.2(C-1)，36.5(C-10)，36.2(C-22)，35.8(C-20)，31.9(C-7，8)，31.7(C-2)，28.2(C-16)，28.0(C-25)，24.3(C-15)，23.8(C-23)，22.8(C-27)，22.6(C-26)，21.1(C-11)，19.4(C-19)，18.7(C-21)，11.9(C-18);EIMS(m/z)：386，353，301，275，255，213，145，107。参考文献[15～18]，确定结构为3-β-5-烯-胆甾醇。
       3.1.3 化合物(Ⅲ～Ⅵ)白色针状晶体，重量：2.5 mg;香草醛显紫褐色;GC-MS分析色谱条件：色谱柱：DB-5(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，进样口温度：260℃，分流进样，柱内流量：1.2 ml/min，程序升温：初始温度60℃，保持2 min，以30℃/min升温至120℃，再以5℃/min升温至280℃保持30 min。GC-MS分析主要成分是胆甾-4-烯-6-酮(Ⅲ)，胆甾-4-烯-3-酮(Ⅳ)，胆甾-4，6-二烯-3-醇(Ⅴ)和胆甾-4，6-二烯-3-酮(Ⅵ)。
       3.2 抗病毒活性实验结果化合物对CVB3的抗病毒作用结果见表1。表1 化合物对CVB3的抗病毒作用结果从表1可知，化合物I、Ⅱ均无抗CVB3病毒效果，对HeLa细胞毒性较大。 化合物对HSV-1的抗病毒作用结果见表2。表2 化合物对CVB3的抗病毒作用结果从表2可知，化合物Ⅱ的IC50达到7.81μg/ml，具有较好的抗HSV-1的作用，但细胞毒性较大，其治疗指数SI并不高。
       4 讨论
       本文对南海大型经济海藻带形蜈蚣藻醇提物的低极性部位进行了分离分析，从中分析鉴定出6个化合物，分别是棕榈酸、3-β-5-烯-胆甾醇、胆甾-4-烯-6-酮、胆甾-4-烯-3-酮、胆甾-4，6-二烯-3-醇和胆甾-4，6-二烯-3-酮，以上均为首次从该海藻中发现。实验中还发现，棕榈酸对人宫颈癌Hela细胞具有较强的细胞毒性，刘红兵等[19]通过对东京枫杨的化学成分及抗肿瘤活性研究表明，棕榈酸是东京枫杨的抗肿瘤活性成分，这与实验结果相符。本实验对化合物Ⅰ、Ⅱ的抗病毒筛选发现，3-β-5-烯-胆甾醇具有较好的抗HSV-1病毒活性，IC50达到7.81 μg/ml。
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